㊀Ｇｕｉｈａｉａ㊀Ａｕｇ.２０２１ꎬ４１(８):１２６３－１２６９
ｈｔｔｐ://ｗｗｗ.ｇｕｉｈａｉａ－ｊｏｕｒｎａｌ.ｃｏｍＤＯＩ:１０.１１９３１/ｇｕｉｈａｉａ.ｇｘｚｗ２０１９１２０２７
张玉秀ꎬ刘杨ꎬ刘培卫ꎬ等.莪术基原植物ＤＮＡ条形码序列的筛选与鉴定[Ｊ].广西植物ꎬ２０２１ꎬ４１(８):１２６３－１２６９. ＺＨＡＮＧＹＸꎬＬＩＵＹꎬＬＩＵＰＷꎬｅｔａｌ.ＳｃｒｅｅｎｉｎｇａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｎＤＮＡｂａｒｃｏｄｉｎｇｓｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆｏｒｉｇｉｎａｌｐｌａｎｔｓｏｆ
ＣｕｒｃｕｍａｅＲｈｉｚｏｍａ[Ｊ].Ｇｕｉｈａｉａꎬ２０２１ꎬ４１(８):１２６３－１２６９.
莪术基原植物ＤＮＡ条形码序列的筛选与鉴定
张玉秀１ꎬ刘㊀杨２ꎬ刘培卫１ꎬ符传坤１ꎬ卢丽兰１ꎬ魏建和１ꎬ２∗(１.中国医学科学院北京协和医学院药用植物研究所海南分所海南省南药资源保护与开发重点实验室ꎬ海口５７０３１１ꎻ２.中国医学科学院北京协和医学院药用植物研究所中草药物质基础与资源利用教育部重点实验室＆
赛尔号洛拉斯克濒危药材繁育国家工程实验室ꎬ北京１００１９３)
摘㊀要：为寻适用于中药材莪术基原植物鉴定的ＤＮＡ条形码序列ꎬ探索快速高效的莪术基原植物鉴定的新方法ꎬ该文首先利用扩增成功率和测序成功率对中药材莪术三种基原植物ꎬ９个样本的７种ＤＮＡ条形码序列(ＩＴＳ㊁ＩＴＳ２㊁ｍａｔＫ㊁ｐｓｂＡ￣ｔｒｎＨ㊁ｔｒｎＬ￣ｔｒｎＦ㊁ｒｐｏ
Ｂ和ａｔｐＢ￣ｒｂｃＬ)进行评估ꎬ然后利用ＭＥＧＡ６.０软件对获得的高质量的序列通过变异位点分析㊁遗传距离计算和系统树分析等进一步进行评估ꎬ最后将筛选到的ＤＮＡ条形码序列对未知基原的待测样品进行基原鉴定ꎮ结果表明:(１)ＩＴＳ㊁ＩＴＳ２和ｍａｔＫ等条形码序列在莪术基原植物中的扩增或测序成功率较低ꎬ难以应用于实际鉴定ꎻ而ｐｓｂＡ￣ｔｒｎＨ㊁ｔｒｎＬ￣ｔｒｎＦ和ｒｐｏＢ条形码序列变异位点信息过少ꎬ不足于区分莪术的三种不同基原植物ꎻ只有ａｔｐＢ￣ｒｂｃＬ条形码序列的扩增和测序成功率较高ꎬ容易获得高质量的序列ꎬ同时序列长度(６４２~６４５ｂｐ)理想ꎬ变异位点多(１１个)ꎬ可实现莪术的三种不同基原的区分鉴别ꎮ(２)待测样品经基于ａｔｐＢ￣ｒｂｃＬ序列构建的系统发育树鉴别为温郁金ꎮ综上所述ꎬ叶绿体ａｔｐＢ￣ｒｂｃＬ序列能够准确鉴定莪术不同基原植物ꎬ可以作为中药材莪术基原植物鉴定的条形码序列ꎮ
关键词：莪术ꎬＤＮＡ条形码ꎬ筛选ꎬａｔｐＢ￣ｒｂｃＬꎬ基原植物鉴定
中图分类号:Ｑ９４３.２㊀㊀文献标识码:Ａ㊀㊀文章编号:１０００￣３１４２(２０２１)０８￣１２６３￣０７
ＳｃｒｅｅｎｉｎｇａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｎＤＮＡｂａｒｃｏｄｉｎｇｓｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆｏｒｉｇｉｎａｌｐｌａｎｔｓｏｆＣｕｒｃｕｍａｅＲｈｉｚｏｍａ
ＺＨＡＮＧＹｕｘｉｕ１ꎬＬＩＵＹａｎｇ２ꎬＬＩＵＰｅｉｗｅｉ１ꎬＦＵＣｈｕａｎｋｕｎ１ꎬＬ
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ＵＬｉｌａｎ１ꎬＷＥＩＪｉａｎｈｅ１ꎬ２∗(１.ＨａｉｎａｎＰｒｏｖｉｎｃｉａｌＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＲｅｓｏｕｒｃｅｓＣｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎａｎｄＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆＳｏｕｔｈｅｒｎＭｅｄｉｃｉｎｅꎬＨａｉｎａｎＢｒａｎｃｈｏｆｔｈｅＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＭｅｄｉｃｉｎａｌＰｌａｎｔＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔꎬＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆＭｅｄｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓａｎｄＰｅｋｉｎｇＵｎｉｏｎＭｅｄｉｃａｌＣｏｌｌｅｇｅꎬＨａｉｋｏｕ５７０３１１ꎬＣｈｉｎａꎻ２.ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＢｉｏａｃｔｉｖｅＳｕｂｓｔａｎｃｅｓａｎｄＲｅｓｏｕｒｃｅｓＵｔｉｌｉｚａｔｉｏｎｏｆＣｈｉｎｅｓｅＨｅｒｂａｌＭｅｄｉｃｉｎｅꎬＭｉｎｉｓｔｒｙｏｆＥｄｕｃａｔｉｏｎ＆ＮａｔｉｏｎａｌＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＬａｂｏｒａｔｏｒｙｆｏｒＢｒｅｅｄｉｎｇｏｆＥｎｄａｎｇｅｒｅｄＭｅｄｉｃｉｎａｌＭａｔｅｒｉａｌｓꎬＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＭｅｄｉｃｉｎａｌＰｌａｎｔＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔꎬＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆ
ＭｅｄｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓａｎｄＰｅｋｉｎｇＵｎｉｏｎＭｅｄｉｃａｌＣｏｌｌｅｇｅꎬＢｅｉｊｉｎｇ１００１９３ꎬＣｈｉｎａ)
收稿日期:２０２０－０１－１４
基金项目：海南省重大科技计划项目(ＺＤＫＪ２０１６００６)[ＳｕｐｐｏｒｔｅｄｂｙＫｅｙＳｃ
ｉｅｎｔｉｆｉｃａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈａｎｄＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔＰｒｏｇｒａｍｏｆＨａｉｎａｎＰｒｏｖｉｎｃｅ(ＺＤＫＪ２０１６００６)]ꎮ
作者简介：张玉秀(１９８４－)ꎬ硕士ꎬ助理研究员ꎬ研究方向为中药质量评价与资源开发ꎬ(Ｅ￣ｍａｉｌ)ｓｃａｕｚｙｘ＠１６３.ｃｏｍꎮ
∗通信作者：魏建和ꎬ研究员ꎬ博士研究生导师ꎬ研究方向为药用植物基因资源㊁分子育种及次生代谢产物调控研究ꎬ(Ｅ￣ｍａｉｌ)ｗｊｉａｎｈ＠２６３.ｎｅｔꎮ
Ａｂｓｔｒａｃｔ:ＩｎｏｒｄｅｒｔｏｆｉｎｄａｒａｐｉｄａｎｄｅｆｆｉｃｉｅｎｔｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｆｏｒｔｈｒｅｅｏｒｉｇｉｎａｌｓｐｅｃｉｅｓｏｆＣｕｒｃｕｍａｅＲｈｉｚｏｍａꎬｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔＤＮＡｂａｒｃｏｄｉｎｇｓｅｑｕｅｎｃｅｓｗｅｒｅｅｖａｌｕａｔｅｄｉｎｐｒｅｓｅｎｔｓｔｕｄｙ.ＴｏｔａｌｌｙｎｉｎｅｓａｍｐｌｅｓｏｆｔｈｒｅｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｓｐｅｃｉｅｓｏｆＣｕｒｃｕｍａｗｅｒｅｃｏｌｌｅｃｔｅｄ.ＡｆｔｅｒＤＮＡｅｘｔｒａｃｔｉｏｎꎬＰＣＲａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇꎬｓｅｖｅｎｋｉｎｄｓｏｆＤＮＡｂａｒｃｏｄｉｎｇｓｅｑｕｅｎｃｅｓꎬｉｎｃｌｕｄｉｎｇＩＴＳꎬＩＴＳ２ꎬｍａｔＫꎬｐｓｂＡ￣ｔｒｎＨꎬｔｒｎＬ￣ｔｒｎＦꎬｒｐｏＢａｎｄａｔｐＢ￣ｒｂｃＬꎬｗｅｒｅｆｉｒｓｔｌ
ｙｃｏｍｐａｒｅｄｉｎｔｅｒｍｓｏｆｓｕｃｃｅｓｓｒａｔｅｏｆＰＣＲａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆｓｅｑｕｅｎｃｅｓ.ＴｈｅｎꎬｂｙｍｅａｎｓｏｆｖａｒｉａｔｉｏｎｓｉｔｅａｎａｌｙｓｉｓａｎｄｇｅｎｅｔｉｃｄｉｓｔａｎｃｅｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎꎬｔｈｅｓｅｓｅｖｅｎｋｉｎｄｓｏｆＤＮＡｂａｒｃｏｄｉｎｇｓｅｑｕｅｎｃｅｓｗｅｒｅｆｕｒｔｈｅｒｅｖａｌｕａｔｅｄ.ＦｉｎａｌｌｙꎬｔｈｅｕｎｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｓａｍｐｌｅｓｗｅｒｅｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｂｙｔｈｅｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃｔｒｅｅｂａｓｅｄｏｎｔｈｅｃｈｏｓｅｎＤＮＡｂａｒｃｏｄｉｎｇｓｅｑｕｅｎｃｅｓ.Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｗｅｒｅａｓｆｏｌｌｏｗｓ:(１)ＩＴＳꎬＩＴＳ２ａｎｄｍａｔＫｂａｒｃｏｄｉｎｇｓｅｑｕｅｎｃｅｓｗｅｒｅｉｎａｐｐｌｉｃａｂｌｅｄｕｅｔｏｔｈｅｌｏｗｓｕｃｃｅｓｓｒａｔｅｏｆＰＣＲａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇꎻＴｈｅｖａｒｉａｔｉｏｎｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆｐｓｂＡ￣ｔｒｎＨꎬｔｒｎＬ￣ｔｒｎＦａｎｄｒｐｏＢｗａｓｉｎｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔｔｏｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈｔｈｒｅｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｏｒｉｇｉｎａｌｓｐｅｃｉｅｓｏｆＣｕｒｃｕｍａｅＲｈｉｚｏｍａꎻＯｎｌｙａｔｐＢ￣ｒｂｃＬｂａｒｃｏｄｉｎｇｓｅｑｕｅｎｃｅｗａｓ６４２－６４５ｂｐｉｎｌｅｎｇｔｈｗｉｔｈ２９.０％－２９.９％ＧＣｃｏｎｔｅｎｔａｎｄ１１ｖａｒｉａｔｉｏｎｓｉｔｅｓꎬｆｏｒｗｈｉｃｈꎬｔｈｅｔｈｒｅｅｓｐｅｃｉｅｓｏｆＣｕｒｃｕｍａｅＲｈｉｚｏｍａｃｏｕｌｄｂｅｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈｅｄｏｎｌｙｂｙａｔｐＢ￣ｒｂｃＬｂａｒｃｏｄｉｎｇｓｅｑｕｅｎｃｅ.(２)Ａｃｃｏｒ
ｄｉｎｇｔｏｔｈｅｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃｔｒｅｅｂａｓｅｄｏｎａｔｐＢ￣ｒｂｃＬｓｅｑｕｅｎｃｅꎬｔｈｅｕｎｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｓａｍｐｌｅｓｗｅｒｅｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄａｓＣｕｒｃｕｍａｗｅｎｙｕｊｉｎ.ＩｎｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎꎬａｔｐＢ￣ｒｂｃＬｓｅｑｕｅｎｃｅｃｏｕｌｄｂｅｕｓｅｄａｓａｓｔａｎｄａｒｄｓｅｑｕｅｎｃｅｆｏｒｔｈｅｒａｐｉｄａｎｄｅｆｆｉｃｉｅｎｔｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｏｒｉｇｉｎａｌｓｐｅｃｉｅｓｏｆＣｕｒｃｕｍａｅＲｈｉｚｏｍａ.
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ:ＣｕｒｃｕｍａｅＲｈｉｚｏｍａꎬＤＮＡｂａｒｃｏｄｅꎬｓｃｒｅｅｎｉｎｇꎬａｔｐＢ￣ｒｂｃＬꎬｏｒｉｇｉｎａｌｐｌａｎｔｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ
㊀㊀中药材莪术由广西莪术(Ｃｕｒｃｕｍａｋｗａｎｇｓｉｅｎｓｉｓ)㊁蓬莪术(Ｃ.ｐｈａｅｏｃａｕｌｉｓ)和温郁金(Ｃ.ｗｅｎｙｕｊｉｎ)的根茎加工而成ꎬ为我国常用中药材ꎬ具有行气破血㊁消积止痛等功效(中国药典ꎬ２０１５)ꎮ现代研究表明ꎬ不同来源莪术的化学成分和药效存在较大差异(吴伯英和李敏ꎬ２０１２)：莪术二酮㊁莪术醇㊁吉马酮和β￣榄香烯等主要有效成分含量在不同来源莪术中有明显差异(毛春芹等ꎬ２０１３)ꎻ药效实验表明温郁金胃癌和肝癌效果最好(唐德才等ꎬ２０１３ꎻ臧文华等ꎬ２０１４)ꎬ妇科药保妇康栓的主要成分莪术油主要来源于温郁金(张永文和杨瑞琦ꎬ２０１０)ꎮ随着国内外市场对莪术需求量的日益增大ꎬ人工种植莪术已成为莪术药材的主要来源(吴正强和赵小文ꎬ２００３)ꎬ为保证栽培选种正确ꎬ临床用药安全有效ꎬ莪术基原植物的准确鉴别亟待解决ꎮ
广西莪术㊁蓬莪术和温郁金均为姜黄属(ＣｕｒｃｕｍａＬ.)植物ꎬ该属植物的传统鉴别主要基于花或叶片等的形态特征(中国植物志ꎬ２００４ꎻＺáｖｅｓｋáｅｔａｌ.ꎬ２０１２ꎻ沈荔荔等ꎬ２０１４)ꎮ莪术三种基原植物形态特征类似极易混淆ꎬ依靠形态特征的传统鉴定和分类比较困难(中国植物志ꎬ２００４ꎻ肖小河等ꎬ２００４)ꎬ而人工栽培以及各地相互引种等因素加剧了分类的不确定性ꎬ因此ꎬ有必要确定各地种植莪术的基原和种质以保证正确种植ꎮ各学者分别运用显微鉴别㊁理化鉴别㊁ＲＡＰＤ分析和化学指纹图谱(肖小河等ꎬ２０００ꎬ２００１ꎻ沈艳等ꎬ２０１４ꎻ杨丰庆等ꎬ２００５ꎻ刘双利等ꎬ２０１６)等对莪术基原植物进行了研究ꎬ但上述方法在实际应用中仍存在不少困难或因序列太长而大大增加了应用的难度(曹晖等ꎬ２０１０)ꎮ
本研究通过对多种ＤＮＡ条形码序列进行筛选ꎬ建立了适用于莪术三种基原植物的ＤＮＡ条形码技术鉴定方法ꎬ同时也为姜黄属植物的分类和鉴定提供一定的参考ꎮ
１㊀材料与方法
１.１材料
本实验共收集１４份材料ꎬ包括９份试验样本和５份待检样本ꎮ蓬莪术㊁广西莪术和温郁金分别采自温州㊁广西㊁四川等道地产区ꎬ待测样本采自海南和江西等引种地ꎬ具体信息见表１ꎮ材料由中国医学科学院药用植物研究所海南分所朱平老师鉴定ꎮ１.２方法
１.２.１样品ＤＮＡ的提取、扩增和测序㊀每个样品取１００ｍｇ新鲜叶片ꎬ参照植物基因组ＤＮＡ提取试剂盒(ＯＭＥＧＡＨＰＰｌａｎｔＤＮＡＫｉｔꎬ美国)提取ＤＮＡꎮ提取后的总ＤＮＡ用微量核酸蛋白测定仪(Ｔｈｅｒｍｏꎬ
４６２１广㊀西㊀植㊀物４１卷
表１㊀植物样品来源与ＧｅｎＢａｎｋ登录号
Ｔａｂｌｅ１㊀ＯｒｉｇｉｎｓａｎｄＧｅｎＢａｎｋａｃｃｅｓｓｉｏｎｎｕｍｂｅｒｓｏｆｐｌａｎｔｓａｍｐｌｅｓ
序号Ｎｏ.编号Ｃｏｄｅ样品名Ｓａｍｐｌｅｎａｍｅ样品来源Ｓａｍｐｌｅｓｏｕｒｃｅ
ＧｅｎＢａｎｋ注册号
ＲｅｇｉｓｔｒａｔｉｏｎｎｕｍｂｅｒｏｎＧｅｎＢａｎｋ
ａｔｐＢ￣ｒｂｃＬｐｓｂＡ￣ｔｒｎＨｒｏｐＢｔｒｎＬ￣ｔｒｎＦ１Ａ１温郁金
Ｃｕｒｃｕｍａｗｅｎｙｕｊｉｎ浙江省瑞安市陶山镇沙洲村ＳｈａｚｈｏｕＶｉｌｌａｇｅꎬＴａｏｓｈａｎＴｏｗｎꎬＲｕｉａｎＣｉｔｙꎬＺｈｅｊｉａｎｇＰｒｏｖｉｎｃｅ
ＭＨ６３４５３９ＭＨ６３４５５２ＭＨ６３１０１０ＭＨ５９６００１２Ａ２温郁金Ｃ.ｗｅｎｙｕｊｉｎ浙江省瑞安市马屿镇
ＭａｙｕＴｏｗｎꎬＲｕｉ ａｎＣｉｔｙꎬＺｈｅｊｉａｎｇＰｒｏｖｉｎｃｅ
ＭＨ６３４５４０ＭＨ６３４５５０ＭＨ６３１００８ＭＨ５７４９１２３Ａ３温郁金Ｃ.ｗｅｎｙｕｊｉｎ浙江省瑞安市南滨街
ＮａｎｂｉｎＳｔｒｅｅｔꎬＲｕｉ ａｎＣｉｔｙꎬＺｈｅｊｉａｎｇＰｒｏｖｉｎｃｅ
ＭＨ６３４５４１ＭＨ６３４５５１ＭＨ６３１００９ＭＨ５７４９１３４Ｂ１广西莪术Ｃ.ｋｗａｎｇｓｉｅｎｓｉｓ广西壮族自治区钦州市灵山县陆屋镇
ＬｕｗｕＴｏｗｎꎬＬｉｎｇｓｈａｎＣｏｕｎｔｙꎬＱｉｎｚｈｏｕＣｉｔｙꎬＧｕａｎｇｘｉＺｈｕａｎｇＡｕｔｏｎｏｍｏｕｓＲｅｇｉｏｎ
自动化控制系统
ＭＨ６３１００１ＭＨ６１５０９４ＭＨ６３４５５９ＭＨ５７４９１９５Ｂ２广西莪术Ｃ.ｋｗａｎｇｓｉｅｎｓｉｓ广西壮族自治区钦州市灵山县陆屋镇
ＬｕｗｕＴｏｗｎꎬＬｉｎｇｓｈａｎＣｏｕｎｔｙꎬＱｉｎｚｈｏｕＣｉｔｙꎬＧｕａｎｇｘｉＺｈｕａｎｇＡｕｔｏｎｏｍｏｕｓＲｅｇｉｏｎ
ＭＨ６３１００２ＭＨ６１５０９５ＭＨ６３４５６０ＭＨ５７４９２０６Ｂ３广西莪术Ｃ.ｋｗａｎｇｓｉｅｎｓｉｓ广西壮族自治区钦州市灵山县陆屋镇
ＬｕｗｕＴｏｗｎꎬＬｉｎｇｓｈａｎＣｏｕｎｔｙꎬＱｉｎｚｈｏｕＣｉｔｙꎬＧｕａｎｇｘｉＺｈｕａｎｇＡｕｔｏｎｏｍｏｕｓＲｅｇｉｏｎＭＨ６３１００３ＭＨ６１５０９６ＭＨ６３４５６１ＭＨ５７４９２１７Ｂ４广西莪术Ｃ.ｋｗａｎｇｓｉｅｎｓｉｓ广西壮族自治区贺州市
ＨｅｚｈｏｕＣｉｔｙꎬＧｕａｎｇｘｉＺｈｕａｎｇＡｕｔｏｎｏｍｏｕｓＲｅｇｉｏｎ
ＭＨ６３４５４２ＭＫ１８８７１９ＭＨ６３４５６６ＭＨ５７４９２２８Ｃ１蓬莪术Ｃ.ｐｈａｅｏｃａｕｌｉｓ四川省成都市崇州市三桥村
ＳａｎｑｉａｏＶｉｌｌａｇｅꎬＣｈｏｎｇｚｈｏｕＣｉｔｙꎬＣｈｅｎｇｄｕＣｉｔｙꎬＳｉｃｈｕａｎＰｒｏｖｉｎｃｅ
ＭＨ６３４５３７ＭＨ６１５０９７ＭＨ６３４５５７ＭＨ５７４９１７９Ｃ２蓬莪术Ｃ.ｐｈａｅｏｃａｕｌｉｓ四川省成都市双流区舟渡村
ＺｈｏｕｄｕＶｉｌｌａｇｅꎬＳｈｕａｎｇｌｉｕＤｉｓｔｒｉｃｔꎬＳｉｃｈｕａｎＰｒｏｖｉｎｃｅ
ＭＨ６３４５４３ＭＨ６１５０９８ＭＨ６３４５５８ＭＨ５７４９１８１０Ｄ１待测样品Ｓａｍｐｌｅｔｏｂｅｔｅｓｔｅｄ海南省临高县
ＬｉｎｇａｏＣｏｕｎｔｙꎬＨａｉｎａｎＰｒｏｖｉｎｃｅＭＨ６３０９９９ＭＨ６３４５４８ＭＨ６３１００７ＭＨ５７４９１５１１Ｄ２待测样品Ｓａｍｐｌｅｔｏｂｅｔｅｓｔｅｄ海南省海口市琼山区
ＱｉｏｎｇｓｈａｎＤｉｓｔｒｉｃｔꎬＨａｉｋｏｕＣｉｔｙꎬＨａｉｎａｎＰｒｏｖｉｎｃｅ
ＭＨ６３１０００ＭＨ６３４５４９ＭＨ６３１００６ＭＨ５７４９１６１２Ｄ３待测样品Ｓａｍｐｌｅｔｏｂｅｔｅｓｔｅｄ海南省澄迈县
ＣｈｅｎｇｍａｉＣｏｕｎｔｙꎬＨａｉｎａｎＰｒｏｖｉｎｃｅＭＨ６３１００４ＭＨ６３４５４７ＭＨ６３１００５ＭＨ５７４９１４１３Ｅ１待测样品Ｓａｍｐｌｅｔｏｂｅｔｅｓｔｅｄ江西省新余市
ＸｉｎｙｕＣｉｔｙꎬＪｉａｎｇｘｉＰｒｏｖｉｎｃｅＭＫ１８８７１４ＭＫ１８８７１７ＭＫ１８８７２３ＭＫ１８８７０６１４
Ｅ２
待测样品Ｓａｍｐｌｅｔｏｂｅｔｅｓｔｅｄ
江西省新余市
ＸｉｎｙｕＣｉｔｙꎬＪｉａｎｇｘｉＰｒｏｖｉｎｃｅ
ＭＫ１８８７１３清华简
ＭＫ１８８７１８
ＭＫ１８８７２４
ＭＫ１８８７０７
美国)进行质量检测ꎮＰＣＲ扩增使用的引物和扩增程序参照相关文献(表２)ꎮＰＣＲ反应体系为２５μＬꎬ其中ꎬ２ｘＥｃｏＴａｑＰＣＲＳｕｐｅｒＭｉｘ(Ｔｒａｎｓｇｅｎꎬ中国)１２.５μＬꎬ正反引物各１μＬꎬＤＮＡ模板２０ｎｇꎮ
ＰＣＲ产物用１％琼脂糖凝胶电泳进行检测ꎮ扩增成功的ＰＣＲ产物送到华大基因公司纯化ꎬ并双向测序ꎮ
１.２.２数据处理㊀利用ＣｏｄｏｎＣｏｄｅＡｌｉｇｎｅｒＶ２.０(ＣｏｄｏｎＣｏｄｅＣｏ.ꎬ美国)对测序峰图进行校对拼接ꎬ去除低质量序列及引物区ꎬ应用相似性搜索法(ＢＬＡＳＴ)进行防错ꎬ将正确的有效序列在ＧｅｎＢａｎｋ注册新序列号(表１)ꎮ运用ＭＥＧＡ６.０进行多序列比对ꎬ计算种内或种间Ｋｉｍｕｒａ２￣ｐａｒａｍｅｔｅｒ(Ｋ２Ｐ)遗传距离并构建ＮＪ系统树ꎮ
２㊀结果与分析
２.１ＰＣＲ扩增和测序
ＩＴＳ㊁ＩＴＳ２序列的ＰＣＲ成功率虽可达到１００％ꎬ
但其测序峰图表现为多位点的无规则套峰ꎬ无法
５
６２１８期
张玉秀等：莪术基原植物ＤＮＡ条形码序列的筛选与鉴定
表２㊀ＰＣＲ引物信息
Ｔａｂｌｅ２㊀Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆｐｒｉｍｅｒｓ
序号
Ｎｏ.目的序列
Ｔａｒｇｅｔｇｅｎｅ引物
Ｐｒｉｍｅｒ引物序列
Ｐｒｉｍｅｒｓｅｑｕｅｎｃｅ参考文献
Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ１ＩＴＳＩＴＳ￣ＬｅｕＧＴＣＣＡＣＴＧＡＡＣＣＴＴＡＴＣＡＴＴＴＡＧ
ＩＴＳ４ＴＣＣＴＣＣＧＣＴＴＡＴＴＧＡＴＡＴＧＣＧｒｏｕｐｅｔａｌ.ꎬ２０１１２ＩＴＳ２ＩＴＳ２￣Ｓ２ＦＡＴＧＣＧＡＴＡＣＴＴＧＧＴＧＴＧＡＡＴ
ＩＴＳ２￣Ｓ３ＲＧＡＣＧＣＴＴＣＴＣＣＡＧＡＣＴＡＣＡＡＴ陈士林ꎬ２０１５３ｐｓｂＡ￣ｔｒｎＨｆｗｄＰＡＧＴＴＡＴＧＣＡＴＧＡＡＣＧＴＡＡＴＧＣＴＣ
ｒｅｖＴＨＣＧＣＧＣＡＴＧＧＴＧＧＡＴＴＣＡＣＡＡＴＣＣ陈士林ꎬ２０１５４ｍａｔＫ３９０
ＦＣＧＡＴＣＴＡＴＴＣＡＴＴＣＡＡＴＡＴＴＴＣ
１３２６ＲＴＣＴＡＧＣＡＣＡＣＧＡＡＡＧＴＣＧＡＡＧＴＧｒｏｕｐｅｔａｌ.ꎬ２０１１５ａｔｐＢ￣ｒｂｃＬａｔｐＢ￣１ＡＣＡＴＣＫＡＲＴＡＣＫＧＧＡＣＣＡＡＴＡＡ
ｒｂｃＬ￣１ＡＡＣＡＣＣＡＧＣＴＴＴＲＡＡＴＣＣＡＡＣｈｉａｎｇｅｔａｌ.ꎬ１９９８６ｔｒｎＬ￣ｔｒｎＦｔｒｎ￣ｅＧＧＴＴＣＡＡＧＴＣＣＣＴＣＴＡＴＣＣＣ中国3d电视试验频道
ｔｒｎ￣ｆＡＴＴＴＧＡＡＣＴＧＧＴＧＡＣＡＣＧＡＧＬｅｅｅｔａｌ.ꎬ２０１６７ｒｐｏＢ１ｆＡＡＧＴＧＣＡＴＴＧＴＴＧＧＡＡＣＴＧＧ
夏望平４ｒＧＡＴＣＣＣＡＧＣＡＴＣＡＣＡＡＴＴＣＣＳａｓｓｅｔａｌ.ꎬ２００７
得到准确单一的序列ꎮｍａｔＫ的平均扩增成功率仅为１８.７５％ꎮｐｓｂＡ￣ｔｒｎＨ㊁ｒｐｏＢ㊁ｔｒｎＬ￣ｔｒｎＦ和ａｔｐＢ￣ｒｂｃＬ的ＰＣＲ扩增效率和测序成功率都为１００％ꎬ序列长度介于３２５~６４５ｂｐ之间ꎬｐｓｂＡ￣ｔｒｎＨ和ｒｏｐＢ的变异位点为０ꎬｔｒｎＬ￣ｔｒｎＦ有１个变异位点ꎬａｔｐＢ￣ｒｂｃＬ在１４个样品间有１１个变异位点(表３)ꎮ
２.２ａｔｐＢ￣ｒｂｃＬ序列特征分析
通过对ａｔｐＢ￣ｒｂｃＬ序列比较发现ꎬ蓬莪术的
ａｔｐＢ￣ｒｂｃＬ序列长度为６４２ｂｐꎬ温郁金和广西莪术的序列长度均为６４５ｂｐꎮ广西莪术与温郁金相比ꎬ仅在５５０位点上存在一个Ｃ到Ｔ转换ꎬ而与蓬莪术相比存在８处碱基的不同ꎬ例如在７６位点Ｃ到Ｔ转换ꎬ２５９位点Ｔ插入ꎬ３１０位点Ｃ到Ｔ转换ꎬ３９７位点Ｃ到Ｔ转换ꎬ４３０位点４个碱基Ｔ缺失等ꎮ待测样品中ꎬ江西新余㊁海南澄迈和临高的
ａｔｐＢ￣ｒｂｃＬ序列与温州温郁金的一致性为１００％ꎬ只有海南琼山与温州温郁金的ａｔｐＢ￣ｒｂｃＬ序列存在一个碱基变异ꎮ
２.３遗传距离计算及基于ａｔｐＢ￣ｒｂｃＬ序列的系统进化树
应用ＭＥＧＡ６.０软件ꎬ基于Ｋ２Ｐ距离模型计算莪术不同基原植物间的遗传距离ꎮ其中广西莪术种内遗传距离均为０ꎬ温郁金的种内遗传距离为０.０００４ꎬ蓬莪术的种内遗传距离为０.００６３ꎻ温郁金与广西莪术种间的平均遗传距离为０.００１８ꎬ温郁金与蓬莪术之间的平均遗传距离均为０.００８１ꎬ广西莪术和蓬莪术种间的遗传距离平均为０.００９５ꎮ待测样品中ꎬ海南样品和温州产温郁金的遗传距离在０~０.００１６之间ꎬ平均遗传距离为０.０００５ꎬ江西样品和温州产温郁金的遗传距离均为０ꎮ
应用ＭＥＧＡ６.０软件构建基于ａｔｐＢ￣ｒｂｃＬ序列的广西莪术㊁温莪术和蓬莪术的ＮＪ系统树(图１)ꎮ在ＮＪ系统树上ꎬ温郁金３个居㊁广西莪术４个居和蓬莪术２个居分别聚为单系分支ꎬ
其中温郁金和广西莪术合聚为一大支ꎬ蓬莪术单独聚为一支ꎬ表明基于ａｔｐＢ￣ｒｂｃＬ序列构建的ＮＪ系统树可将温郁金㊁广西莪术㊁蓬莪术三个物种明显分开ꎬ而温郁金与广西莪术的关系较近而与蓬莪术关系较远ꎮ待测样品都与温州产温郁金聚在同一分支(图１)ꎮ
３㊀讨论与结论
ＤＮＡ条形码技术自２００３年提出以来ꎬ已成为
６６２１广㊀西㊀植㊀物４１卷
表３㊀不同ＤＮＡ条形码序列的评估
Ｔａｂｌｅ３㊀ＥｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔＤＮＡｂａｒｃｏｄｉｎｇｓｅｑｕｅｎｃｅｓ
参数
ＰａｒａｍｅｔｅｒＩＴＳＩＴＳ２ｍａｔＫｐｓｂＡ￣ｔｒｎＨａｔｐＢ￣ｒｂｃＬｔｒｎＬ￣ｔｒｎＦｒｐｏＢ样本数量
Ｎｏ.ｏｆｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ
１４１４１４１４１４１４１４ＰＣＲ成功率
ＰＣＲｓｕｃｃｅｓｓｒａｔｅ(％)
１００１００１８.７５１００１００１００１００测序成功率
Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｓｕｃｃｅｓｓｒａｔｅ(％)０
７.１４７５１００１００１００１００序列长度
Ｓｅｑｕｅｎｃｅｌｅｎｇｔｈ(ｂｐ)２４６
６１９６４２６４２~６４５３２５~３２６
３４１变异位点数
Ｎｏ.ｏｆｖａｒｉａｂｌｅｓｉｔｅｓ
１
０
１１
１
０
图１㊀基于ＮＪ法(ａｔｐＢ￣ｒｂｃＬ数据)构建的系统树Ｆｉｇ.１㊀Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃｔｒｅｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄｂａｓｅｄｏｎ
ＮＪｍｅｔｈｏｄｓ(ａｔｐＢ￣ｒｂｃＬｄａｔａ)
全球生物分类研究的热点和方向(陈士林等ꎬ２０１３)ꎮ由于植物的核苷酸进化速率低于动物ꎬ且植物存在更多杂交和多倍化的进化事件ꎬ植物中没有一个单独的片段能像动物ＣＯＩ一样成为高效和通用条形码ꎮ因此ꎬ筛选一个或多个适合植物分类的ＤＮＡ条形码序列成为十分重要的研究内容(Ｃｈｅｎｅｔａｌ.ꎬ２０１０ꎻＧｒｏｕｐｅｔａｌ.ꎬ２０１１)ꎮ本研究在ＩＴＳ㊁ＩＴＳ２㊁ａｔｐＢ￣ｒｂｃＬ㊁ｍａｔＫ㊁ｐｓｂＡ￣ｔｒｎＨ㊁ｔｒｎＬ￣ｔｒｎＦ和ｒｐｏＢ等７条ＤＮＡ条形码候选序列中ꎬ从ＰＣＲ扩增的难易程度ꎬ测序成功率和变异程度等方面ꎬ筛选到了一条适宜鉴定莪术基原植物ＤＮＡ条形
码序列ａｔｐＢ￣ｒｂｃＬꎮ
核基因ＩＴＳ和ＩＴＳ２在莪术类植物间的测序成功率很低ꎬＣｈｅｎｅｔａｌ.(２０１４)认为这主要是由于多倍体杂交和多年人工栽培造成的ꎮ虽可通过构建单克隆载体的方式得到ＩＴＳ２序列ꎬ但这
无疑增加了成本和难度ꎬ且在姜黄属内能提供分辨率仅为４６.７％(Ｃｈｅｎｅｔａｌ.ꎬ２０１４)ꎮｍａｔＫ是植物ＤＮＡ条形码研究的核心条形码序列之一(Ｌｅｉｓｔｅｒｅｔａｌ.ꎬ
１９９８)ꎬ但它在本研究的样本中ＰＣＲ扩增效率最低(１８.７５％)ꎬ类似的问题在其他植物中也多有报道(Ｓａｓｓｅｔａｌ.ꎬ２００７ꎻＨｏｌｌｉｎｇｓｗｏｒｔｈｅｔａｌ.ꎬ２００９ꎻＣｈｅｎｅｔａｌ.ꎬ２０１４)ꎮＣｈｅｎｅｔａｌ.(２０１４)利用多对引物和多次摸索后ꎬ将姜黄属ｍａｔＫ序列扩增成功率
提高至８５.４％ꎬ却发现姜黄属ｍａｔＫ序列不存在ｂａｒｃｏｄｅｇａｐ(Ｃｈｅｎｅｔａｌ.ꎬ２０１４)ꎮ我们利用其序列进行分析ꎬ发现ｍａｔＫ序列不能将莪术不同基原植物分开ꎮ从ＰＣＲ扩增效率和测序成功率考虑ꎬ我们认为ｍａｔＫ㊁ＩＴＳ和ＩＴＳ２这三条序列不适宜作为莪术基原植物鉴定的候选序列ꎮ
ｐｓｂＡ￣ｔｒｎＨ㊁ｒｏｐＢ㊁ｔｒｎＬ￣ｔｒｎＦ和ａｔｐＢ￣ｒｂｃＬ这四条序列在本研究中的扩增和测序成功率均为１００％ꎬ但前三个序列在这些样本中极度保守㊁进化速率慢ꎬ其种间差异为零或差异极小ꎬ而ａｔｐＢ￣ｒｂｃＬ存在丰富的变异ꎮ因此ꎬ我们将其作为莪术不同基原植物鉴定的适宜序列ꎮ在此基础上ꎬ本研究基于ａｔｐＢ￣ｒｂｃＬ序列ꎬ通过计算遗传距离和构建ＮＪ系统树ꎬ将«中国药典»中莪术的三种基原植物明显区分开ꎬ同时鉴定结果说明海南和江西引种的样品
７
６２１８期张玉秀等：莪术基原植物ＤＮＡ条形码序列的筛选与鉴定
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