李凌凌;吕早生;吴敏;袁向利;关海燕;张敏
【摘 要】醛酮还原酶是氧化还原酶家族成员之一,能对很多羰基底物进行氧化还原.综述了醛酮还原酶家族的命名、结构、保守氨基酸序列、催化机制、结合辅酶方式和结合底物的特异性;阐述了醛酮还原酶生理作用的研究方法;介绍了醛酮还原酶在手性醇合成方面的应用. 【期刊名称】《化学与生物工程》
【年(卷),期】2009(026)011
【总页数】7页(P62-67,90)
【关键词】醛酮还原酶家族;辅酶;底物特异性;手性醇;不对称合成
【作 者】李凌凌;吕早生;吴敏;袁向利;关海燕;张敏
【作者单位】武汉科技大学化学工程与技术学院,湖北,武汉,430081;武汉科技大学化学工程与
技术学院,湖北,武汉,430081;西部矿业股份有限公司国家级企业技术中心,青海,西宁,810001;武汉科技大学化学工程与技术学院,湖北,武汉,430081;武汉科技大学化学工程与技术学院,湖北,武汉,430081;武汉科技大学化学工程与技术学院,湖北,武汉,430081
【正文语种】中 文
出版管理条例【中图分类】Q554+.2
醛酮还原酶(AKR)是氧化还原酶超家族成员之一，在生物界中广泛存在，能对很多羧基底物进行氧化还原，特别是对生物体而言是很强突变剂的醛或酮中间产物[1]。醛酮还原酶通常都是单体，约含320个氨基酸残基，大小约为35 kDa，其底物谱很广，包括脂肪族和芳香族的醛基、酮基、单糖、类固醇、前列腺素等。
目前有三种已知的酶显示出了典型的醛酮还原酶家族特性：第一种是醛还原酶(Aldehyde reductase，EC1.1.1.2)，能催化各种醛基的还原，如糖醛酸；第二种是醛糖还原酶(Aldose reductase，EC1.1.1.21)，能催化乙醇醛和多羟基醛等的还原，但对糖醛酸中醛基的还原活性较弱；第三种是羰基还原酶(Carbonyl reductase，EC1.1.1.184)，能催化醌、酮基及醛基还原成相应的醇。
1 醛酮还原酶的命名
醛酮还原酶的命名方式为：词头“AKR”代表醛酮还原酶，其后的阿拉伯数字代表其所属的家族，接着的字母代表亚家族，最后的阿拉伯数字代表其独特的蛋白质序列[2]。例如：蛋白质AKR7A1是指醛酮还原酶第七个家族的亚家族A，其编码基因为AKR7A1。对于多聚体的醛酮还原酶，则根据其组成成分的比例来命名，如：AKR7A1-AKR7A4(1∶3)指的是一个四聚体，其组成为1分子的AKR7A1和3分子的AKR7A4。
2 醛酮还原酶的家族成员
AKR超家族目前已经分成了15个家族(AKR1～AKR15)，约有150个家族成员，还有约130个未列入家族中的还未确定功能的蛋白质，它们也很有可能具有醛酮还原酶活性。这种最初由Jez提出的分类方式是根据蛋白质序列分类的[3]。
AKR家族成员间的氨基酸相似度低于40%，而每个家族内部成员间的相似度却远远大于60%。当蛋白质具有大于97%的氨基酸一致性时，被认为是一类，除非它们具有不同的酶活性或不同的3′非翻译区(UTR)，或者具有不同的基因结构和/或染体定位[2]。在15个家
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族中，最大的家族是AKR1，其家族成员有醛糖还原酶、醛还原酶、羟基类固醇脱氢酶等。
3 醛酮还原酶的结构
AKR家族成员的催化中心为D-Y-K-H，且以β-折叠的羧基端与辅酶结合，这与短链脱氢酶不同，后者是通过Rossmann折叠区域和NAD(P)(H)结合[4]。
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AKR家族成员都具有相同的三维结构：(α/β)8桶状折叠(以大麦醛糖还原酶即AKR4C1的结构为例，见图1a)，结构中具有8个平行的β-折叠，每个β-折叠都和一个α-螺旋交替，α-螺旋和β-折叠呈反向平行，且β-折叠的羧基端是通过一些可变长度的环与α-螺旋的氨基端结合，这些环形成了活性中心，实际上，参与底物结合和催化作用的残基主要在三个环——A-、B-和C-环上(图1b)并根据它们在一级结构上的位置命名，A-环位于残基124～142，B-环位于残基219～225，C-环位于残基292～320，均在桶状结构的羧基端，非常柔软，从而使得酶能适应不同大小形状的底物，并控制催化等分子事件[5]。AKR家族成员中这三个环的长度和氨基酸序列均不同。此外，AKR结构中的发夹结构(B1+B2)封锁了桶状结构的一端[而NAD(P)H的结合位点位于另一端][6]，该结构具有高度保守的辅酶结合“口袋”，并有物探软件
两个辅助的α-螺旋H1和H2，其中α-螺旋H1定在辅酶结合环的一端，负责连接第7个β-折叠和第7个α-螺旋，而α-螺旋H2则锚定在羧基端环的第8个α-螺旋之后。
图1 AKR(大麦醛糖还原酶)的三维结构[6]Fig.1 A common three-dimensional structure of AKR(Hordeum vulgare aldose reductase)
3.1 AKR家族成员中的保守氨基酸
醛酮还原酶家族的序列比对结果显示含有三个保守序列：N端为LxxxGxxxPxxGxG(x代表可变氨基酸)，活性中心为GxxxDxAxxY(其中含有保守的Asp和Tyr)，还有一个保守区域为LxxxxxxxxxDxxxxH(含有保守的His)。
所有AKR家族成员的一级结构中，有11个位点的氨基酸是严格的保守[7]：Gly22、Gly45、Asp50、Lys84、Asp112、Pro119、Gly164、Asn167、Pro186、Gln190和Ser271(这里的数字根据3α-羟基类固醇脱氢酶即AKR1C9的蛋白质残基顺序编号)。另外，有41个家族成员在额外的8个位点的氨基酸是保守的：Gly20、Tyr55、Gly62、Leu113、Trp148、Gly158、Glu192、Arg276。其中Asp50、Asn167、Gln190、Ser271和Arg276是与辅酶结
合的位点；Asp50、Tyr55、Lys84、His117是催化中心。而额外的保守氨基酸用以维持三维结构。
醛酮还原酶中最主要的变化区域在C端区域，这对于保证酶的底物特异性非常重要[7]。
非诚勿扰徐莹3.2 醛酮还原酶的催化机制
醛酮还原酶的活性中心通常由酪氨酸Tyr、组氨酸His、天冬氨酸Asp和赖氨酸Lys这4个氨基酸组成，但也有例外，如在人类固醇5β-还原酶即AKR1D1中His替换为Glu[8]，而在调控电压门控钾离子通道的AKR6A3、AKR6A5、AKR6A9中，Asn替换了His[9]。在催化中心的4个氨基酸残基中，Tyr是质子的供体，赖氨酸与天冬氨酸残基的羧基形成盐桥，并与酪氨酸羟基形成氢键，这样形成的氢键/盐桥可降低Tyr的pKa值，促进质子转移。His117因其周围的疏水环境，能降低咪唑侧链的pKa值，使其在生理pH值下较难作为质子供体。Asp的侧链与辅酶的核糖羟基形成氢键，该残基对于催化过程并不是必要的。水分子结合在Tyr55、His117和与酶结合的NADP+分子之间，这样有利于羰基底物的定位。Tyr55、His117及烟酰胺环形成一个氧阴离子洞[7]。在AKR1D1中，替换His的E120主要有两种作用[8]：一是使得类固醇结构复合体均可以插入到活性中心狭洞中，而不至于被His的咪唑侧 链所阻碍，这样反应可以在NADPH的4-pro-R氢阴离子(AKR上转移的氢阴离子的立体化学结构为4-pro-R，因此，又称为4-pro-R氢阴离子[8])和类固醇的C5位置之间发生；二是E120与类固醇的C3酮基产生氢键，且侧链处于反式构象的E120产生了“酸性”的氧阴离子洞，能使类固醇的C3烯醇化并促进氢阴离子的转移[8]，如图2所示。
图2 类固醇5β-还原酶的催化机制[8]Fig.2 Catalytic mechanism of steroid-5β-reductase
AKR催化的酶促反应过程为：辅酶NAD(P)H先结合到AKR上，接着底物再结合到AKR上，通过一种“推-拉”机制进行转化反应，待反应结束后，先释放产物，再释放出氧化态的辅酶。这也许是因为与NADPH结合，酶的构型才会发生改变，才可以进一步与底物结合，整个过程中辅酶最先结合到酶，最后从酶上释放下来，属于“Ordered bi-bi机制”[5]。AKR催化的还原反应为两步[10](图2)：首先将4-pro-R氢阴离子(即带一对电子的质子)从NAD(P)H上转移到底物羰基上；然后，质子从酶上的Tyr转移到氧阴离子中间体，Tyr和Lys之间形成的氢键促进该转移过程，His分子可能参与了质子的转移过程，或者与氧阴离子形成氢键，从而稳定了该中间体[6]。
3.3 醛酮还原酶结合辅酶的方式
大多数的醛酮还原酶都以NADPH作为辅酶，某些酵母木糖还原酶既能以NADH，也能以NADPH作为辅酶[11]。以Candida tenuis木糖还原酶(CtXR)为例，其X-衍射结果说明CtXR会针对辅酶含有或不含有2′-磷酸基团两种情况，诱导出两种不同的酶构型。研究也表明：野生型CtXR虽然可以NADH作为辅酶，但是更倾向与NADPH结合。而构建的CtXR突变体(K274突变成R、N276突变成D)，与野生型CtXR相比，对于NADH的亲和力要比NADPH高5倍。另外，Pichia stipitis的NAD(P)H依赖的D-木糖还原酶的结构中，与NAD(H)、NADP(H)的结合位点，均是由16个氨基酸形成的亲水性结合口袋，该口袋与NAD(H)结合时，Glu223和Phe236与辅酶形成的氢键起到至关重要的作用。而与NADP(H)结合时，Lys21和Phe236与辅酶形成的氢键起到作用[12]。
AKR家族中的成员与辅酶NAD(P)H的结合方式几乎一致，都在延伸状态的桶状结构的羧基端。其中NAD(P)H的烟酰胺环结合在桶状结构的中心，焦磷酸横跨酶裂口的两端(在β-7和β-8折叠之间)，而腺嘌呤单磷酸部分则结合于螺旋α-7、α-8和B-环之间。其中一小部分B-环在辅酶结合后会发生构象变化，将NADPH的焦磷酸部分锁定在正确的位置，这是整个反应的限速步骤，对于辅酶的结合和反应最后辅酶的释放都至关重要。此外，烟酰胺环与Tyr216接触，使得辅酶能面向活性中心，以保持从4-pro-R面进行氢阴离子转移。在此方向
ert上，烟酰胺环在核糖的反方向，而保持这个方向需要Ser166、Asn167和Gln190与辅酶的酰胺基团形成氢键。Asp50和Thr24与NADPH中的核糖相互作用，而焦磷酸骨架与B-环的Leu219和Ser221之间形成氢键。最终，腺嘌呤2′-单磷酸通过Arg270、Ser271、Phe272、Arg276、Glu279和Asn280与酶之间产生广泛的氢键和离子键(以3α-羟基类固醇脱氢酶为例，见图3)[7]。
图3 AKR(3α-羟基类固醇脱氢酶)结合辅酶方式Fig.3 Schematic of NADP+ binding in the AKRs
连接第一个β-折叠和第一个α-螺旋的环(称为β1-α1-环，位于残基33～36)，为较大的柔软的辅酶结合环，又称之为“安全带”。在所有AKR家族中，β1-α1-环均参与了结合辅酶NADPH，并在辅酶结合后跨越其上，以确保形成NADPH/NADP+核苷酸底物。在AKR结构中，β1-α1-环的构型变化较大，该结构变化对于确保辅酶的释放是必须的，且被认为是整个反应的限速步骤。但其氨基酸序列并非保守[6]。如兔20α-羟基类固醇脱氢酶(AKR1C5)的辅酶结合口袋中His222和Lys270残基侧链形成盐桥，覆盖在辅酶中心的磷酸链上，即安全带[5]。又如大麦醛糖还原酶中，Arg33的Nη原子和Glu221及Ser219侧链上的
O原子之间形成氢键，产生“安全带”(图4)，另外，Ser219的侧链、Trp32的N原子和辅酶直接作用。而细菌的2,5-二酮基-D-葡萄糖酸还原酶A和Gcy1p均缺少这个安全带，导致对NADPH的结合情况有所变化[6,13]，特别是Gcy1p对NADPH的亲和力较其它醛酮还原酶要低很多[13]。
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