第29卷第2期 高 校 化 学 工 程 学 报 No.2 V ol.29 2015 年4 月 Journal of Chemical Engineering of Chinese Universities Apr. 2015 文章编号：1003-9015(2015)02-0495-06
朱银龙, 贠军贤, 沈绍传, 姚克俭
(浙江工业大学化学工程学院绿合成技术国家重点实验室培育基地, 浙江杭州310032)
摘要：苯乳酸是由乳酸菌属等微生物代谢合成的一种新型食品防腐剂。今利用透性化干酪乳杆菌(Lactobacillus casei B3)细胞转化苯丙酮酸，合成得到了苯乳酸，并通过单因素实验和正交实验，确定了适宜的转化条件，即：干酪乳杆菌
在−20℃冷冻6 h后用于转化，苯丙酮酸浓度为8 g⋅L−1，葡萄糖浓度为14 g⋅L−1，菌浓度为100 g⋅L−1，pH值为8.0，温 度为35℃，转速为75 r⋅min−1，转化时间为4 h；优化条件下苯乳酸的收率达65.5%，转化液中苯乳酸浓度达到了5.3 g⋅L−1。
关键词：苯丙酮酸；苯乳酸；透性化；干酪乳杆菌
中图分类号：TS201.2 文献标识码：A DOI：10.3969/j.issn.1003-9015.2015.02.039
Biotransformation of Phenylpyruvic Acid into Phenyllactic Acid with Permeabilized
Lactobacillus Casei Cells
ZHU Yin-long, YUN Jun-xian, SHEN Shao-chuan, YAO Ke-jian
(State Key Laboratory Breeding Base of Green Chemistry Synthesis Technology, College of Chemical Engineering, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310032, China)
Abstract: Phenyllactic acid is a novel food preservative produced by some strains of lactic acid bacteria. In this work, phenyllactic acid was synthesized from phenylpyruvic acid with permeabilized Lactobacillus casei B3cells. The biotransformation process was optimized by single factor and orthogonal experiments, which resulted in an optimized transformation condition as 6 h freezing time for the L. casei B3 cells at −20℃ with phenylpyruvic acid concentration of 8 g⋅L−1, glucose concentration of 14 g⋅L−1, cell concentration of 100 g⋅L−1, pH value of 8.0, temperature of 35℃ and shaking rate of 75 r⋅min−1 for 4 h. The phenyllactic acid yield (defined as the molar ratio of the final
phenyllactic acid to the substrate phenylpyruvic acid in the broth) was 65.5% and the phenyllactic acid concentration reached to 5.3 g⋅L−1 under such conditions.
Key words: phenylpyruvic acid; phenyllactic acid; permeabilized; Lactobacillus casei
1 前言
苯乳酸(phenyllactic acid, PLA)，也称3-苯基乳酸或2-羟基-3-苯基丙酸，可以由许多微生物产生[1,2]，特别是乳酸菌[3~6]，也存在于天然蜂蜜中[7]。苯乳酸具有溶解性好，较宽的pH范围和热稳定性好的优点，能抑制腐败菌、致病菌以及真菌的感染，是一种新型的天然防腐剂，在食品行业中有广阔的前景[1,3,8,9]。苯乳酸是丹参素的衍生物之一，可以抑制血小板凝集[10]，调节人体内类固醇水平[11]，合成降血糖制剂Englitazone[12]，合成抗HIV试剂[13]等。苯乳酸的合成主要有化学合成和生物合成，化学合成存在环境污染、技术复杂、反应条件苛刻等局限性[14,15]。生物合成苯乳酸具有反应条件温和、无污染、成本低等优点，而乳酸菌是被公认为安全(Generally recognized as safe, GRAS)的微生物，较容易储存和工业化，所以，
收稿日期：2013-09-27；修订日期：2013-12-20。
基金项目：浙江省自然科学基金重点项目(LZ14B060001)；科技部中欧政府间国际合作专项项目(1017)。
作者简介：朱银龙(1989-)，男，浙江嵊州人，浙江工业大学硕士生。通讯联系人：贠军贤，E-mail：**************
496 高校化学工程学报 2015年4月
近年来乳酸菌合成苯乳酸已成为了研究重点[16~22]。
目前，苯丙氨酸(phenylalanine, Phe)转化生成苯乳酸的产量较低，其转化途径为苯丙氨酸↔苯丙酮酸→苯乳酸(见图1)，由于转氨反应是其限制步骤[17,18]，而苯丙酮酸(phenylpyruvic acid, PPA)代替苯丙氨酸可以使苯乳酸的产量大幅度提升[19,20]。本实验室从泡菜中筛选得到一株干酪乳杆菌(Lactobacillus casei B3)，可以合成苯乳酸。本文通过冷冻透性化细胞法，在缓冲液体系中对苯丙酮酸转化合成苯乳酸的条件进行优化，以提高苯乳酸的产量及收率。
图1 乳酸菌转化苯丙氨酸为苯乳酸的途径
斯科拉扣篮Fig.1 Pathway for PLA production from Phe by Lactobacillus strains
2材料和方法
2.1材料
2.1.1 菌种和培养基
菌种：干酪乳杆菌(L. casei B3)由本实验室从泡菜中筛选得到，并保藏在本实验室及中国典型培养物保藏中心(CCTCC AB 2013357)。
肉汤培养基(MRS培养基)：葡萄糖20 g⋅L−1，蛋白胨10 g⋅L−1，酵母膏5 g⋅L−1，牛肉膏10 g⋅L−1，柠檬酸二胺2 g⋅L−1，无水乙酸钠5 g⋅L−1，硫酸锰0.25 g⋅L−1，硫酸镁0.58 g⋅L−1，吐温80 1 mL⋅L−1，磷酸氢二钾2 g⋅L−1。
平板培养基：在MRS培养基中加入质量分数3%的碳酸钙和2%的琼脂。
2.1.2 主要试剂和仪器
苯乳酸、苯丙酮酸、苯丙氨酸、谱甲醇，购自Sigma公司(USA)；谱三氟乙酸，购自阿拉丁试剂(上海)；葡萄糖、蛋白胨、酵母膏、琼脂，购自生工生物工程有限公司(上海)；其他均为国产分析纯试剂。生化培养箱，上海实业有限公司；摇床，太仓华利达实验设备有限公司；TG16-WS台式高速离心机，上海卢湘仪离心机仪器有限公司；超纯水系统(Milli-Q Synthesis)，Millipore(USA)；高效液相谱系统(HPLC，1260 Infinity)，Agilent(USA)。
2.2方法
2.2.1 培养方法
从平板培养基上挑取生长良好的单菌落，接种于20 mL的MRS培养基中活化12 h，以2%(V/V)接种量再移至一定体积的MRS培养基中，在30℃下静置培养24 h后离心(8000×g 15 min)，洗涤两次后用于转化反应。
2.2.2 透性化细胞转化方法
在50 mL的锥形瓶中，将葡萄糖、苯丙酮酸、缓冲液和冷冻透性化后的细胞按一定比例配成5 mL 的反应液，在一定pH、温度及转速下反应一定时间，离心，取上清液测苯乳酸含量。
2.2.3 苯乳酸的测定
HPLC条件：Agilent 1260 infinity 液相谱系统，DAD 检测器(G1315D)，Agilent Zorbax SB-C18 谱柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)；水+0.05%三氟乙酸(A)和甲醇+0.05%三氟乙酸(B)为流动相，梯度洗脱：0~20 min时候B由10%线性变化为100%，20~23 min保持100%，23~25 min线性降为10%；流速1 mL⋅min−1，检测波长210 nm，柱温30℃。所有标准品和样品在进样前均用0.22 µm微孔滤膜过滤，进样量20 µL。
第29卷第2期 朱银龙等：透性化干酪乳杆菌细胞转化苯丙酮酸合成苯乳酸 4
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Shaking rate / r ⋅min −1
图4 转速对PLA 浓度的影响 Fig.4 Effects of shaking rate on PLA concentration P L A c o n c e n t r a t i o n / g ⋅L −1
3 结果与讨论
3.1 转化液pH 值对转化生成苯乳酸的影响
采用透性化L. casei B3细胞，转化条件为：菌在−20℃冷冻80 min ，苯丙酮酸浓度为2 g ⋅L −1，葡萄糖浓度为10 g ⋅L −1，菌浓度为100 g ⋅L −1，温度为40℃，转速为120 r ⋅min −1，改变pH 值(100 mmol ⋅L −1磷酸缓冲液，pH 值分别为6.0、6.5、7.0、7.5、8.0；100 mmol ⋅L −1乙酸-乙酸钠缓冲液，pH 值分别为4.5、5.0、5.5；100 mmol ⋅L −1 Tris-HCl 缓冲液，pH 值分别为8.5和9.0)，考察其对转化液中苯乳酸浓度的影响。从图2中可以看出，L. casei B3细胞通透化后转化苯丙酮酸合成苯乳酸的最适pH 值在7.0~8.0，本实验中最适pH 为7.5左右。原因可能是由于菌对底物的转化受溶液pH 值的影响，pH 值影响酶的活性等。
3.2 温度对转化生成苯乳酸的影响
采用透性化L. casei B3细胞，转化条件为：菌在-20℃冷冻80 min ，苯丙酮酸浓度为2 g ⋅L −1，葡萄糖浓度为10 g ⋅L −1，
菌浓度为100 g ⋅L −1，100 mmol ⋅L −1磷酸缓冲液(pH 7.5)，转速为120 r ⋅min −1，改变温度(温度分别为25、30、35、40、45、50、60℃)，考察其对转化液中苯乳酸浓度的影响。从图3中可以看出，经过冷冻处理后，乳酸菌对苯丙酮酸的转化有比较好的温度区间，在25~50℃间都比较稳定，本实验中35℃时最好，60℃时急速下降。原因可能是由于温度对酶的稳定性、活性以及催化反应的热力学常数等有影响；而温度过高可能使酶失活。 3.3 转速对转化生成苯乳酸的影响
采用透性化L. casei B3细胞，转化条件为：菌在-20℃冷冻80 min ，苯丙酮酸浓度为2 g ⋅L −1，葡萄糖为10 g ⋅L −1，菌浓度为100 g ⋅L −1，100 mmol ⋅L −1磷酸缓冲液(pH 7.5)，温度为35℃，改变转速(转速分别为60、75、90、120、150 r ⋅min −1)，考察其对转化液中苯乳酸浓度的影响。从图4中可以看出在60~90 r ⋅min −1时较合适，本实验中75 r ⋅min −1最好。原因可能是转速太低使菌与底物之间的传质不充分；而转速的提高，产生的剪切力不断增加，苯乳酸浓度有所下降。 3.4 冷冻时间对转化生成苯乳酸的影响
采用透性化L. casei B3细胞，转化条件为：苯丙酮
酸浓度为2 g ⋅L −1，
葡萄糖为10 g ⋅L −1，菌浓度为100 g ⋅L −1，在100 mmol ⋅L −1磷酸缓冲液(pH 7.5)，温度35℃，转速为75 r ⋅min −1，改变菌的通透化时间(将菌在-20℃分别冷冻1、1.3、2、4、6、8、12、24、48 h)，考察其对所得苯乳酸浓度的影响。图5中看出，通透化时间对L. casei B3细胞合成苯乳酸的影响不大，在本实验中，通透化6 h 效果最佳。原因可能是通透化时间太短，细胞壁和细胞膜阻碍底物与酶的充分接触；时间太长，影响细胞中酶的活性。
pH
P L A c o n c
e n t r a t i o n / g ⋅L −1
图2 pH 对PLA 浓度的影响 Fig.2 Effects of pH on PLA concentration
Temperature / ℃
图3 温度对PLA 浓度的影响
Fig.3 Effects of temperature on PLA concentration
P L A c o n c e n t r a t i o n / g ⋅L −1
498 高 校 化 学 工 程 学 报 2015年4月
3.5 葡萄糖浓度对转化生成苯乳酸的影响
采用透性化L. casei B3细胞，转化条件为：菌在−20℃冷冻6 h ，苯丙酮酸浓度为2 g ⋅L −1，菌浓度为100 g ⋅L −1，100 mmol ⋅L −1磷酸缓冲液(pH 7.5)，温度35℃，转速为75 r ⋅min −1，改变葡萄糖浓度(
葡萄糖浓度分别为2、6、10、14、18 g ⋅L −1)，考察其对所得苯乳酸浓度的影响。图6中可以看出，葡萄糖浓度在6~18 g ⋅L −1的时候都比较合适，
本实验中最佳葡萄糖浓度为6 g ⋅L −1。原因可能是由于葡萄糖浓度的增加有利于为苯乳酸的合成提供能量；过高则抑制了其能量的合成，从而影响苯乳酸的合成。 3.6 底物浓度对转化生成苯乳酸的影响
采用透性化L. casei B3细胞，转化条件为：菌在−20℃冷冻6 h ，葡萄糖为6 g ⋅L −1，菌浓度为100 g ⋅L −1，100 mmol ⋅L −1磷酸缓冲液(pH 7.5)，温度35℃，转速为75 r ⋅min −1，改变苯丙酮酸浓度(2、4、6、8、10、12、14 g ⋅L −1)，考察其对所得苯乳酸浓度的影响。图7中可以看出，产PLA 的收率随底物浓度增加而呈下降趋势。底物浓度对苯乳酸的产量影响比较大，当苯丙酮酸浓度在10 g ⋅L −1时，苯乳酸的浓度最大达到4.2 g ⋅L −1，底物浓度再增加，苯乳酸浓度开始下降。原因可能是由于底物浓度增加可以促进苯乳酸的合成，太高也会有抑制作用。 3.7 正交实验设计
根据单因素实验结果，选定pH 、葡萄糖浓度、转速、底物浓度4个因素，采用正交表L 9(34)对这4个因数进行综合考察，研究对其PLA 产量的影响。影响因素A 为葡萄糖浓度，选取水平：6、10、14 g ⋅L −1；影响因素B 为苯丙酮酸浓度，选取水平：8、10、12 g ⋅L −1
；影响因素C 为转速，选取水平：75、105、135 r ⋅min −1；影响因素D 为pH 值，选取水平：7.0、7.5、8.0。正交实验结果如表1。
Y i e l d / %
古镇文化公园
P L A c o n c e n t r a t i o n /g ⋅L −1
PPA concentration / g ⋅L −1
图7 PPA 浓度对PLA 浓度的影响
Fig.7 Effects of PPA concentration on PLA
concentration and yield
表1 正交实验结果
Table 1 Results of the orthogonal experiment
NO A
B
C
D PLA concentration
垂直与平行教学设计
Glucose concentration / g ⋅L −1
PPA concentration / g ⋅L −1
Shaking rate / r ⋅min −1
pH / g ⋅L −1 1 6 8 75 7.0 3.63±0.30 2
6 10 105 7.5 3.99±0.09 3 6 12 135 8.0 3.82±0.23 4
10 8 105 8.0 4.47±0.22 5 10 10 135 7.0 1.84±0.08 6
10 12 75 7.5 3.26±0.09 7 14 8 135 7.5 4.64±0.09 8 14 10 75 8.0 5.72±0.09 9 14 12 105 7.0 1.24±0.08
k1 3.813 4.247 4.203 2.237 k2 3.190 3.850 3.233 3.963 k3 3.867 2.773 3.433 4.670 R 0.677
1.474
有一种新型节能灯
0.970
2.433
Freezing time / h 图
5 冷冻时间对PLA 浓度的影响
Fig.5 Effects of freezing time on PLA concentration
P L A c o n c e n t r a t i o n / g ⋅L −1
Glucose concentration / g ⋅L −1
图6 葡萄糖浓度对PLA 浓度的影响
Fig.6 Effects of glucose concentration on PLA concentration
P L A c o n c e n t r a t i o n / g ⋅L −1
第29卷第2期 朱银龙等：透性化干酪乳杆菌细胞转化苯丙酮酸合成苯乳酸 499
从表中可以看出各个因素对PLA 产量的影响大小顺序为：pH ＞底物＞转速＞葡萄糖，根据各个组合苯乳酸产量确定出的最优组合为A 3B 2C 1D 3，PLA 产量为5.72 g ⋅L −1，收率为56.5%；但是根据k 值，B 的最佳条件为B 1，此时最优组合为A 3B 1C 1D 3，而此组合未出现在正交实验中，因此在此基础上进一步做三组平行实验，PLA 平均产量为5.3 g ⋅L −1，收率为65.5%。综合考虑PLA 产量及收率，
选择A 3B 1C 1D 3为最佳条件，该结果在产量上优于沐万孟[21]
等通
过乙醚渗透化Lactobacillus sp. SK007细胞转化苯丙酮酸合
成苯乳酸(3.38 g ⋅L −1)。
3.8 优化条件下PLA 浓度随时间的变化
在优化后的条件下：菌在−20℃冷冻6 h ，苯丙酮酸浓度为8 g ⋅L −1，葡萄糖浓度为14 g ⋅L −1，菌浓度
为100 g ⋅L −1，pH 值为8.0，温度为35℃，转速为75 r ⋅min −1。从图8中可以看出，PLA 在30 min 的时候产量迅速达到3.2 g ⋅L −1，此后缓慢上升，4 h 转化达到平衡。经过透性化处理的干酪乳杆菌细胞能较快将苯丙酮酸转化为苯乳酸。
4 结 论
经过透性化处理的L. casei B3细胞，能较好的实现苯丙酮酸转化为苯乳酸。通过单因素实验和正交实
验的设计优化，其优化结果是：菌在-20℃冷冻6 h ，苯丙酮酸浓度为8 g ⋅L −1，葡萄糖浓度为14 g ⋅L −1，菌浓度为100 g ⋅L −1，
pH 值为8.0，温度为35℃，转速为75 r ⋅min −1，转化4 h ，苯乳酸浓度达到了5.3 g ⋅L −1，收率为65.5%。对比正交实验优化结果与单因素实验优化结果，PLA 产量提高了26.2%，收率提高了57.7%。该实验冷冻透性化处理方法比较环保，同时优化后的PLA 产量也有明显的提升，可为后续生物合成苯乳酸的工业化打下基础。快乐女生练歌房
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P L A c o n c e n t r a t i o n / g ⋅L −1
图8 优化条件下PLA 浓度随时间的变化 Fig.8 Change of PLA concentration as a function
time under optimized conditions
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