文章编号（Article ID）：1009－2137（2012）02－0458－08·论著·
宁雪，李栋，汪大琨，付金秋，鞠秀丽*
山东大学齐鲁医院儿童医疗中心，山东济南250012
摘要本研究探讨人脐带间充质干细胞（UC-MSC）在体外培养的衰老过程中细胞生物学特征及衰老相关基因的变化特点。体外分离培养UC-MSC，取第3代（对照组）和第15代（衰老组）细胞进行形态学观察、增殖检测、流式表型测定和人类全基因组表达谱芯片分析，并选取重要基因进行定量逆转录多聚酶链反应验证。结果显示，与对照组相比，衰老组细胞形态变大，增殖速度减慢，但CD44和CD105等细胞表型阳性率无变化；衰老细胞组的核糖体小亚基组成相关基因显著上调，上调的信号通路主要涉及类固醇合成、半乳糖代谢、自身免疫病和退行性疾病；下调明显的是细胞骨架，DNA、mRNA结构的结合以及蛋白质功能等相关基因，与细胞黏附功能和细胞增殖周期等相关。结论：第15代的UC-MSC出现细胞代谢与增殖功能下降，从而导致细胞衰老。
关键词脐带间充质干细胞；衰老；基因表达；信号通路
中图分类号R329．28文献标识码A
Changes of Biological Characteristics and Gene Expression Profile of Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells During Senescence in Culture
NING Xue，LI Dong，WANG Da-Kun，FU Jin-Qiu，JU Xiu-Li*
Department of Pediatrics，Shandong University Qilu Hospital，Jinan250012，Shandong Province，China
*Corresponding Author：JU Xiu-Li，Senior Physician，Professor．Tel：（0531）82169214．E-mail：shellysdcn@hotmail．com
Abstract This study was purposed to investigate the changes of biological properties and expression patterns of the aging related genes in umbilical cord mesenchymal stem cells（UC-MSC）during in vitro culture．UC-MSC at passage3 were served as the control cells and those at passage15were considered as the aged cells．The biological features of those two kinds of cells including morphology，proliferation activity and phenotypic profile were observed，and the differences of gene expression were analysed by the whole human genome oligo microarray．Several differential
genes were selected for further confirmation by quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction．The results showed that UC-MSC at passage15were larger in size and their proliferation rate was slower compared with those of cells at passage3，while the positivity of CD44and CD105remained unchanged．Compared with UC-MSC at passage3，relatively aged cells expressed higher levels of genes that are associated with small subunit of ribosome．Further analysis with Gene Ontology functional categories showed that the up-regulated genes were concentrated in those related to steroid biosynthesis，galactose metabolism and the development of autoimmune diseases and degenerative diseases and the down-regulated genes in UC-MSC at passage15were concentrated in cytoskeleton molecules，DNA structure binding，mRNA binding and protein function．Functional analysis with Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes functional pathway revealed that the expression of some genes responsible for ribosome composition was elevated while those of associated with extracellular matrix，focal adhesion and cell cycle progression were down-regulated．It is concluded that UC-MSC become senescent due to the declines in metabolism and proliferation activities．
Key words umbilical cord mesenchymal stem cell；aging；gene expression；signal pathway
J Exp Hematol2012；20（2）：458－465
脐带间充质干细胞（umbilical cord mesenc-hymal stem cells，UC-MSC）来源于脐带华通胶（Wharton's jelly）血管周围组织，具有多向分化和免疫调控能力［1］，目前已广泛应用于实验和临床研究。研究已证明UC-MSC能促进神经［2］、心肌［3］和骨骼［4］等组织的损伤修复，减轻造血干细胞移植相关移植物抗宿主病［5］，缓解自身免疫病和代谢紊乱性疾病［4，6］。UC-MSC应用于临床需要达到一定的细胞数量。有文献报道，移植物抗宿主病时，静脉输注UC-MSC的中位有效量为2ˑ106/
基金项目：山东省科技发展计划项目，编号2009GG10002027
*通讯作者：鞠秀丽，博士生导师，主任医师．电话：（0531）82169214．E-mail：shellysdcn@hotmail．com
2011－09－30收稿；2011－10－24接受
·
854
·中国实验血液学杂志Journal of Experimental Hematology2012；20（2）：458－465
kg［7］。因此，需要在体外进行UC-MSC扩增。但正常细胞的体外培养是有代数限制的，随着细胞复制次数的增加，细胞的形态发生改变、增殖能力下降［8］，细胞趋于衰老，功能也发生变化。衰老也属于发育生物学的范畴，本工作研究UC-MSC体外衰老过程中的基因差异性表达，探索衰老的分子生物学机制，为临床应用提供参考。本研究中选取第3代UC-MSC作为对照与第15代UC-MSC进行比较，观察细胞的形态学和表型变化。然后用基因表达谱芯片（gene expression chip）检测衰老的UC-MSC特异性表达的基因，并进行GO聚类（gene ontology functional categories）和KEGG信号通路（kyoto encyclopedia of genes and genomes functional pathway）分析。最后，在差异基因中选取细胞周期、信号通路、细胞外基质、DNA修复和细胞凋亡等的相关重要基因，进行定量RT-PCR验证。
材料和方法
材料
脐带来自山东大学齐鲁医院产科足月正常分娩产妇（产妇知情同意），α-MEM和胎牛血清（FBS）购自Hyclone公司，碱性磷酸酶染试剂盒购自上海太阳生物技术有限公司，TRIzol试剂和青、链霉素购自Invitrogen公司，逆转录和PCR试剂盒购自天根公司，流式单克隆抗体均购于Becton Dickinson公司，细胞观察使用日本Olympus公司IX71倒置显微镜，PCR使用美国ABI公司7500型定量PCR仪。
UC-MSC培养与观察
无菌取脐带2cm，去血管后剪碎，组织块贴壁法培养于α-MEM培养液中（含10%FBS），于37ħ、5% CO
2
、100%湿度培养箱培养，取第3代细胞作为对照组，连续培养到第15代的细胞为衰老组，倒置显微镜下观察细胞形态，并分别预置盖玻片制成细胞爬片。预置的盖玻片在爬满细胞后取出，细胞经固定、脱水和干燥后用IB-5离子溅射仪中镀铂，日立S-570扫描电镜观察并拍照。
细胞增殖动力学检测区域文化
分别取对照组和衰老组细胞，以1ˑ104/ml密度接种于96孔培养板中，每孔200μl。两组细胞各设8个复孔，培养6d。按照CCK-8试剂盒提供的操作步骤，每日检测在450nm波长处测吸光度
（OD
450nm
）值。以培养时间为横坐标，OD值为纵坐标绘制细胞增殖曲线。细胞表型的流式细胞术检测
细胞用0．1%胰酶-0．1%EDTA-PBS溶液消化后充分吹打成单细胞悬液（密度1ˑ106/ml），使用美国Becton Dickinson公司FACS Calibur型流式细胞仪检测并分析细胞CD34、CD45、CD44和CD105等表型变化。
体外诱导分化能力鉴定与细胞染
为研究UC-MSC向成骨细胞和成脂肪样细胞的体外诱导分化潜能，将第3代和第15代培养细胞置于不同的诱导培养液中诱导分化，起始密度为2ˑ104/cm2。成骨细胞诱导培养液组分：低糖DMEM 中含10%FBS，0．1μmol/L地塞米松，50mmol/L β-甘油磷酸钠和0．2mmol/L抗坏血酸。成脂细胞诱导培养液组分：高糖DMEM中含0．25mmol/L IBMX，0．1μmol/L地塞米松，0．1mmol/L吲哚美辛，6．25μg/ml胰岛素和10%FBS。
诱导分化14d后，细胞用4%多聚甲醛固定，成骨细胞碱性磷酸酶染按照试剂盒说明进行，阳性信号为蓝紫；对于成骨细胞钙沉积，使用1%茜素红S水溶液染10min，钙沉积处为红沉淀；脂肪细胞使用0．3%油红O及60%异丙醇溶液染30min，然后使用60%异丙醇清洗，苏木精复染1min，脂肪颗粒染为红。
RNA提取和基因表达谱芯片检测
细胞用PBS洗涤后加入TRIzol试剂，按操作说明提取总RNA。基因表达谱芯片杂交、检测和数据分析由上海康成生物公司进行，表达谱芯片中共有41000条人类基因（Agilent公司芯片，编号14850）。杂交结束后清洗，用DNA芯片扫描仪行微阵列扫描。扫描结果通过Agilent Gene Spring GX software 进行标准化分析，与对照组相比4倍变化为差异表达，并进行GO及KEGG通路分析。
定量RT-PCR验证
根据基因表达谱的结果，选取多个典型的差异基因进行实时定量PCR验证。总RNA提取和逆转录按照试剂盒说明书操作。逆转录体系为20μl，其中包括总RNA（1μg）、10ˑRT缓冲液、dNTP混合液、RNA酶抑制剂、逆转录酶和寡聚胸腺嘧啶引物。混合体系于37ħ孵育60min获得cDNA。
实时定量PCR以SYBR Green为荧光染料，使用ABI7500PCR系统。所用引物由博尚公司合成（序列见表1）。选取β-actin为内参基因，目的基因的表达量通过2－△Ct方法与内参基因对比〔△Ct=（Ct
mRNA
－
Ct
β-actin RNA
）〕。PCR程序：95ħ预变性10min；然后
·
954
·
脐带间充质干细胞体外衰老过程中生物学特性及基因表达谱的变化
95ħ变性15s ，62ħ退火1min ，共40个循环。
Table 1．Primers used in quantitative RT-PCR
Gene definition Primer Sequence （5'－3'）
Product length （bp ）
BLACK-SCHOLES模型β-actin CTCCTCCTGAGCGCAAGTACTC
91TCCTGCTTGCTGATCCACATC PDK1TGCAATGAGAGCCACTATGGAA 74CCAGCGTGACATGA
ACTTGAA SMAD2AGACACCAGTTTTGCCTCCAGTA 70TCCAGAGGCGGAAGTTCTGT IGF3BP5ATCTTCCGGCCCAAACACA 90TCTTTCTGCGGTCCTTCTTCA FADD CCCCCGCAACCTGACA
70TGCGTTCTCCTTCTCTGTGTTC PIK3CB CGCTCTGGCCTCATTGAAGT 78AGCAGCCACATTGCTACTGTTC CCND2GTTCCTGGCCTCCAAACTCA
79CTTGATGGAGTTGTCGGTGTAAAT CDK6TGGTACAGAGCACCCGAAGTC 70AGCCAACACTCCAGAGATCCA COL3A1GGGAATGGAGCAAAACAGTCTT 117CAACGTCCACACCAAATTCTTG COL4A1CAGCTGCCTGCGCAAGTT
84TAGTCATTTCGTGATGCAAAGTTG HSPA1A ACCAAGCAGACGCAGATCTTC 72GCCCTCGTACACCTGGATCA
JAK 2AACTGCAGATGCACATCATTACCT 82GCCATGACAGTTGCTTTGTATATTTT LAMC2CACAACACAGCCGGCATCTA 71GGGTTGGGAGCCAATGG MGMT ACCAGCCCGAGGCTATCG
70AACGACTCTTGCTGGAAAACG
PAK2TCTGTTAAGCTCACTGACTTTGGTTT 74CCGACCATGGTACTGCGTTT SMAD4
AGCACCCCAGCTCTGTTAGC 74
GCCACAGGAATGTTGGGAAA
数据分析
数据采用Microsoft excel 2003软件分析，
3次独立实验的数据以珔X
ʃSD 表示。结果
基本生物学特征
光学显微镜检显示，对照组第3代细胞呈典型的成纤维状，平均长度约为30μm ，每平方毫米可达500个细胞（图1A ）；衰老组细胞个体差异较大，但均呈扁平状，细胞变得宽大，每平方毫米仅有约150个细胞，衰老细胞核质比减小（图1B ）。扫描电子显微镜下可见年轻组细胞形态饱满，细胞表面分布均匀
的微绒毛（图1C ），
而衰老组细胞表面光滑，细胞伪足增多，整体扁平（图1D ）
。
Figure 1．Morphology of UC-MSC under optical
microscope （A and B ，ˑ200）and scanning electron microscope （C and D ）．
细胞表型检测什邡市实验小学
流式细胞仪检测结果表明，所获得的贴壁细胞CD34和CD45均为阴性表达，对照组和衰老组细胞CD44和CD105均高表达，组间阳性率表达并无显著差异（图2）
。
Figure 2．Phenotypes of young and aged UC-MSC including CD34，CD45，CD44and CD105detected
by flow cytometry．lbe
俄罗斯人·
064·中国实验血液学杂志J Exp Hematol 2012；20（2）
细胞诱导分化
在适当的分化条件诱导下，所获得第3代对照组贴壁细胞能向成骨和脂肪细胞分化。向成骨细胞诱导分化后，细胞渐渐聚集生长，诱导14d 后大部分细胞出现钙化胞外基质，茜素红S 染阳性（图3A ），碱性磷酸酶染阳性（图3B ）；向脂肪细胞诱导分
化1周后，细胞开始变得宽大，
10d 后约80%细胞内出现油红O 阳性的脂肪颗粒（图3C ，新三国穿帮
D ）。这些结果证明，所获得的贴壁细胞符合MSC 的特征。而
衰老组第15代细胞在相同的诱导条件下，
成骨方向所获得的细胞聚集能力弱，茜素红S
染仍呈弱阳
Figure 3．Induced differentiation results of umbilical cord derived adhesive cells．A ，E ：alizarin red staining ；B ，F ：ALP staining ；C ，G ：adipocytic differ-entiation with broadened morphology ；D ，H ：formation of lipid vacuoles on oil-red O staining （Bar length =50μm ）．P3：passage 3UC-MSC ；P15：passage 15UC-MSC．
性（图3E ），但碱性磷酸酶染仅有少量细胞为阳性（图3F ）；成脂方向诱导后出现的含脂肪细胞少，而
且细胞内的油红O 阳性的脂肪颗粒小（图3G ，
H ），虽经延长诱导时间并不能增加诱导效率。
增殖检测检测表明，对照组和衰老组细胞的增殖曲线在接种后都有1个停滞期，然后进入增殖期。对照组UC-MSC 能更快地进入增殖期，并在第5天进入平台期；而衰老组细胞停滞期长，增殖率较低（图4）
。
Figure 4．Proliferation curves of UC-MSC in
culture for 6days．
KEGG 通路分析
衰老组细胞与对照组细胞差异表达基因KEGG 通路分析显示，衰老组显著上调通路有20条，下调通路
49条（P ＜0．05）。上调通路中，涉及核糖体的通路随衰老过程变化最为显著。此外，与合成代谢、自身免疫紊乱性和退行性疾病相关基因在衰老细胞中也显著上调（表2）。下调通路主要涉及3大类信号通路，包括细胞外基质和细胞连接、物质代谢和细胞增殖相关通路（表3）。
Table 2．
KEGG functional analysis of up-regulated
pathways in aged UC-MSC
Pathway ID
Definition
Enrichment score
hsa03010Ribosome
18．62hsa05322Systemic lupus erythematosus 16．5hsa00190Oxidative phosphorylation 14．92hsa05012Parkinson's disease 11．46hsa05016Huntington's disease 8．94hsa05010Alzheimer's disease 8．32hsa05323Rheumatoid arthritis 4．26hsa00100Steroid biosynthesis
3．04hsa04621NOD-like receptor signaling pathway 2．27hsa00052Galactose metabolism
1．83
·
164·脐带间充质干细胞体外衰老过程中生物学特性及基因表达谱的变化
Table3．KEGG functional analysis of down-regulated pathways in aged UC-MSC
Pathway ID Definition Enrichment
score
hsa04510Focal adhesion9．65
hsa04110Cell cycle6．18
hsa04141Protein processing in endoplasmic reticulum5．57
hsa04120Ubiquitin mediated proteolysis5．07
hsa05200Pathways in cancer5．05
hsa04962Vasopressin-regulated water reabsorption4．91
hsa04520Adherens junction4．87
hsa04512ECM-receptor interaction4．8
hsa04350TGF-beta signaling pathway4．8
hsa04114Oocyte meiosis4．69
GO聚类分析
GO聚类分析结果共分3部分：生物进程、细胞组分和分子功能。在UC-MSC的衰老过程中显著上调的生物进程如表4A所示，其中脱氧核糖核酸的代谢过程相关基因上调最为显著，其他上调的生物进程包括电子转运系统、翻译的终止、MHC-Ⅰ介导的抗原递呈、宿主对病毒的防御反应的调节、脂多糖介导的信号转导等。在衰老过程中下调的生物进程（表4B）最为显著的是纺锤体微管-染体的附着，此外还包括微管功能、核内物质运输、蛋白质包被以及细胞对未折叠蛋白质的处理。在衰老中上调的细胞组分主要为核糖体及呼吸链组分（表4C），其中
Table4A．Up-regulated GO terms of differentially expressed genes in aged UC-MSC according to biological process
GO．ID Term Multiple of enrichment
GO：0009264deoxyribonucleotide catabolic process6．09 GO：0009219pyrimidine deoxyribonucleotide metabolic process4．77 GO：0002474antigen processing and presentation of peptide antigen4．74 GO：00093942'-deoxyribonucleotide metabolic process4．43 GO：0006120mitochondrial electron transport，NADH to ubiquinone4．33 GO：0050691regulation of defense response to virus by host4．10 GO：0006415translational termination4．08 GO：0031663lipopolysaccharide-mediated signaling pathway4．06 GO：0042773ATP synthesis coupled electron transport3．95 GO：0042775mitochondrial ATP synthesis coupled electron transport3．95 The results are representative of repeatable experiments．Table4B．Down-regulated GO terms of differentially expressed genes in aged UC-MSC according to biological process
GO．ID Term
Multiple of
enrichment GO：0051313attachment of spindle microtubules to chromosome4．16 GO：0006607NLS-bearing substrate import into nucleus4．11 GO：0034453microtubule anchoring4．05 GO：0007184SMAD protein import into nucleus3．82 GO：0007076mitotic chromosome condensation3．66 GO：0030968endoplasmic reticulum unfolded protein response3．56 GO：0034620cellular response to unfolded protein3．56 GO：0007016cytoskeletal anchoring at plasma membrane3．56 GO：0007020microtubule nucleation3．56 GO：0034644cellular response to UV3．56 The results are representative of repeatable experiments．
Table4C．Up-regulated GO terms of differentially expressed genes in aged UC-MSC according to cell components
GO．ID Term
Multiple of
enrichment GO：0022627cytosolic small ribosomal subunit4．9 GO：0000314organellar small ribosomal subunit4．76 GO：0005763mitochondrial small ribosomal subunit4．76 GO：0015935small ribosomal subunit4．65 GO：0005747mitochondrial respiratory chain complex I4．58 GO：0030964NADH dehydrogenase complex4．58 GO：0045271respiratory chain complex I4
．58 GO：0045263proton-transporting ATP synthase complex4．45 GO：0000313organellar ribosome4．30 GO：0005761mitochondrial ribosome4．30
The results are representative of repeatable experiments．
以核糖体组分和呼吸链组分衰老组上调最为显著；而衰老组下调组分主要有肌蛋白和细胞器相关的组分（表4D）。衰老MSC表达基因中分子功能上调显著的主要是多种酶的活性（表4E），例如NADH 脱氢酶和氧化还原酶（受体为NAD等）；而衰老组下调基因多涉及物质的结合功能，最为显著的是黏着斑蛋白的结合功能，其他还有DNA二级结构、微管正端、蛋白多糖以及核苷酸的结合，酶活性的下调则以甘露糖苷酶最显著（表4F）。
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·中国实验血液学杂志J Exp Hematol2012；20（2）
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