网络出版时间：2022-12-2510：51网络出版地址：httpe:///kcme/detS/34.1265.R.22221222.1126.002.html
刘莉，顾亚男，周宏，李名聪，罗欣，张胜权
摘要目的研究羊毛固醇合成酶抑制剂(RO)单独或联合胆固醇(CH)使用对皮肤角质形成细胞(KCs)细胞增殖及细 胞周期的影响。方法RO不同剂量作用KCs—定时间，采用MTS比法检测KC/细胞增殖的变化；使用一定浓度的RO单独或联合CH作用KC/不同时间，使用MTS比法和流式细胞仪检测记录KC/细胞增殖和细胞周期的变化；单独使用相同浓度RO或联合CH经过不同时间刺激KC/后通过蛋白质免疫印迹法对细胞周期蛋白Cyc/nBl、Cyc/nE 表达水平进行分析。结果RO抑制KC/细胞增殖，并呈浓度和时间依赖性；联合使用CH降低RO对KC/的增殖抑制作用;RO可时间依赖性增加KCs细胞周期在G2期比例，联合使用CH缓慢增加KCs周期在G2期比例;RO可时间依赖性降低细胞周期调控蛋白Cyc/nBl、CyclmE的表达，联合使用CH部分拮抗RO下调Cyc/nE，并具有时间效应，而Cy-c/nBl的表达没有受到明显的影响。结论RO可能通过影响Cyc/nBl、Cyc/nE的表达使KC)细胞周期G1期阻滞进而抑制KCs增殖。 关键词RO；CH；KCs；细胞增殖；细胞周期蛋白
中图分类号R3
文献标志码A文章编号1000-1492(ZU)02-0176-04 doi：10.19405//cnki.iss/1200-1492.042).02.002
甲羟戊酸途径是各种生命活动中关键的代谢途径之一，该途径主要与细胞内信号转导、细胞增殖等生理活动进程相关。该途径产生众多的中间产物与下游产物，其中主要包括甲羟戊酸(mevalonic, MVK)、香叶焦磷酸(geranylgeranyl pyrophosphate, GGPP)、法尼基焦磷酸(famesyy pyrophosphate, FPP)、羊毛固醇(lanosterol,LAN)、胆固醇(cColet-terol,CH)等多种脂类物质［］。研究发现在甲羟戊酸途径中关键酶编码的基因突变能导致单基因遗传疾病，并且这些疾病中的大部分都表现出了皮肤损伤［-5］。皮肤是人体抵御外界侵袭的第一道屏障，参与构成的主要是表皮，由角质形成细胞(keratino- 2022-25-12接收
基金项目：国家自然科学基金(编号：81271763)
作者单位：安徽医科大学科研实验中心，合肥235032
作者简介：刘莉，女，硕士研究生；
张胜权，男，博士，教授，硕士生导师，责任作者,E-mail：
sqz36@yahoo,com cyte/KCs)组成。有研究发现表皮是甲羟戊酸代谢途径最活跃的场所之一⑷。甲羟戊酸途径作为影
响生命活动的重要途径，在细胞中受到严格的控制，该途径的代谢异常可能参与癌症、心血管系统和神经系统等疾病的发生发展［5-6］o研究表明羊毛固醇合成酶抑制剂(RO48-8071)能够抑制乳腺癌细胞中CH的合成，从而无法形成胆固醇类固醇激素的合成前体，下调雌激素水平，抑制乳腺癌细胞增殖［2］o此外，该实验室前期研究指出MVK的杂合突变可导致播散型浅表性汗孔角化症(disseminated superficial actinic porokeratosis,DSAP)［］，这些都表明甲羟戊酸代谢途径在皮肤生长发育和疾病转化过程中扮演重要角，但其具体的调控机制尚不清楚o 该研究使用了羊毛固醇合成酶抑制剂RO探讨甲羟戊酸途径异常对KC)增殖的影响并探索其分子机制。
l材料与方法
14主要试剂小牛血清、MEPICF500培养基、2.06mo/L Nact、Coating Matrin基质、HKGS(102 x)和2.25%胰酶均购于美国GiNcy公司；Dispase 购于美国Sigma公司；细胞周期试剂盒购于中国上海碧云天生物公司；MTS试剂盒购于美国Promega 公司；Cyc/n B1、Cyc/nE及0-actin均购于美国Ab-cam公司；二抗购于北京中杉金桥生物有限公司。
l42方法
1.0.0原代皮肤角质形成细胞培养取新鲜切除的包皮组织，生理盐水浸泡清洗后用无血清无双抗的DMEM培养基清洗3~5次，用无菌手术剪剪去多余皮下组织并清洗表面细菌，然后将皮肤组织剪成0.5cmx
2.5cm大小的组织块，用2.2%中性蛋白酶在4°C消化过夜，期间上下颠倒1~2次，充分消化；次日用无菌镊子分离表皮和真皮，表皮中加入2.025%胰酶(含2.21%EDTA)置于32C孵箱中消化5min，用含12%胎牛血清DMEM培养基终止胰酶消化；使用220目滤网研磨过滤细胞,1500 r/min,5min离心，去上清液收集细胞沉淀，按照原代皮肤细胞培养要求配置MEPILF550培养基并以
3xl49个/mi的细胞数接种，细胞培养瓶置于37咒，5%CO.孵箱传代培养3代后用于本实验研究。
1.0.0MTS法检测细胞增殖消化收集在对数生长期的KCs细胞，并以细胞计数为3X143个/mi，接种于99孔板，每孔140以细胞悬液，置于37°C, 5%CO.孵箱培养1d后加入RO药液，使终浓度为
2.1、2.3、1.2、
3.2、10.0、32.2、100.2p no/L，并设对照组(2pmo/L)，继续贴壁培养3d后加入MTS 试剂，按照试剂盒使用说明书用酶标仪检测OD值。同上述方法接种96孔板,RO(14p mo/L)单独或联合CH(44p mol/L)刺激KCs，刺激时间分别为1、2、3d，对照组培养孔中加入相同浓度的PBS，培养3d 后加入MTS试剂，按照试剂盒使用说明书用酶标仪检测OD值。根据OD值计算每组细胞存活率。
1.0.0细胞周期检测消化收集在对数生长期的KCs细胞，接种于14孔板使细胞接种最终计数为5 X149个/mi，置于37C,5%CO.孵箱贴壁培养过夜，单独加入RO(14pmol/L)或联合CH(44 p mo/L)刺激KCs，刺激时间分为1、2、3d，对照组培养液中加入相同浓度的PBS o3d后胰酶消化再次收集细胞，按照周期试剂盒操作指南，用流式细胞仪检测细胞周期。检测数据结果用F/wjo7.6.1分析。
1.2.4细胞周期相关蛋白检测提取细胞总蛋白，并按照14p/孔上样量进行SDS-PAGE分离蛋白。用14%分离胶分离电泳后，将蛋白质从分离胶中转移到PVDF膜上，用5%的脱脂奶粉膜室温摇床封闭2h o1:1002稀释CyclNB1、CyclNE及1: 522稀释0-actin抗体作为一抗,4C孵育过夜。TBST漂洗，1:14000稀释二抗，室温孵育2h。TBST漂洗，滴加化学发光液进行发光和系统成像。陕北
1.3统计学处理采用SPSS16.2统计软件对数据进行分析，计量数据以o±s表示，行a检验和方差分析,P<
2.25为差异有统计学意义。
2结果
2.1RO抑制KCs细胞增殖RO抑制KCs细胞增殖，并呈浓度依赖性,MTS结果显示RO药物IL. =14pmol/L，与对照组比较差异有统计学意义(P <2.25)o RO可呈时间依赖性抑制KCs细胞增殖，在作
用3d时,KCs细胞相对存活率最低(35%)，与对照组比较差异有统计学意义(a=54.047,P< 2.25),RO联合CH作用KCs细胞后,CH削弱RO 对KCs的增殖抑制作用，在联合CH处理3d KCs 细胞相对存活率最低(67%)，与对照组比较差异有统计学意义(^14.036,P<2.23)o见图1。
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RO(pmol/L)
_■对照组
RO
■RO+CH liirihii
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专解男题
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图1RO单独或联合CH刺激KCs后对细胞存活率的影响
A：使用不同浓度的RO药物刺激KCs3d后对细胞存活率的影响；B：RO(12|xmol/T)单独或联合CH(40|xmol/T)处理KCs不同时间后细胞存活率的变化；与对照组比较：*P<2.23
2.2RO对KCs细胞周期的影响当RO药物浓度(14pmol/T)一定时，随着作用时间的增加,KCs 细胞周期中的G1期细胞比例上升，在1、2、3d实验组G1期DNA平均含量为6
3.12%、71.54%和33.16%，与对照组(5
4.39%)比较差异有统计学意义(F=53.0,P<2.23)o S期呈现下降的趋势，在1、2、3d实验组细胞S期DNA平均含量为23.75%220.43%和9.11%，与对照组(3
5.28%)比较差异有统计学意义(F=
6.635,P<2.25)；G2期细胞比例没有明显变化。RO联合CH处理KCs 细胞后,KCs细胞周期中的G1期细胞比例缓慢上升,S期随着作用时间的增加呈现缓慢下降的趋势，而G2期细胞比例没有显著变化。见图2o
2.3周期蛋白表达蛋白质凝胶电泳结果显示RO 单独处理KCs的细胞内Cyc/nB1、CyclNE蛋白的表达受到明显抑制作用，RO联合CH处理KCs细胞后,RO对CyclNE抑制表达作用减弱，在联合CH处理2d最显著(P<2.23)；但CH对CyclNB1水平的降低没有显著影响。见图3o
----
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o o o o o 0 5 0 52 11lunoo
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Gl=72.43%o绿夫妻
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B o o
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|10°-50-
°t
S=15.39%G2=6.71%
2M 4M 6M 8M FL2-A::PE-A
图2 RO 单独或联合CH 对KCs 细胞周期的影响
A ：RO 药物单独处理KCs 不同时间后KCs 细胞周期的变化；
B ：RO 联合CH 处理KCs 不同时间KCs 细胞周期的变化；
C ：统计RO 单独作
用KCs 不同时间后各细胞周期比例变化;D ：统计RO 联合CH 作用KCs 不同时间后各细胞周期比例变化;a ：0 d ；b ：l d ；c ：2 d ；d ：3 d ；与2d 比 较：P<2. 25
A
Cyclin E
CyclinBl P-actin
.8.64.2
.0.8.64.2.01X 1A
o v o o o
B 启
百止二
huhoao
□ RO
■RO+CH
.86
4.2.O .8642.O 11 11 11 11 11 o o o o o
c 启g
盒 u
h o a o
□ RO
广德县卫生局
图3 Westerg blot 分析周期蛋白表达
A ：RO 单独或联合CH 作用KC ）不同时间后KC ）细胞内Cyc/nBl 、CyclNE 表达水平的变化;
B ：分析Cyc/nBl 表达;
C ：分析Cyc/nE 表达;a ：
2d ；b ：l d ；c ：2d ；d ：3 d ；与同时间段 RO 组比较：* P<2.05
3讨论
甲轻戊酸途径是机体重要的代谢活动之一，能
够为细胞提供多种营养活性分子。皮肤是人体最大
的器官，该器官功能的正常与甲轻戊酸代谢途径顺 利进行息息相关。有研究表明，甲轻戊酸途径中的 法尼斯基二磷酸合成酶抑制剂（帕米膦酸盐）可诱
导细胞人口腔角质形成细胞衰老和p63的表达，并 抑制KCs 增殖⑼。HMG-CoA 还原酶抑制剂（他汀
类、二磷酸盐如唑来膦酸及胺丁轻磷酸盐）能通过
改变细胞周期相关蛋白表达从而抑制原代角质形成细胞增殖[2]0在本研究中当RO单独作用于KCs 细胞后，细胞周期的G1期阻滞，抑制细胞增殖，并且细胞周期蛋白Cyc/nB1、CyclNE的表达随着作用时间的增加而减少。前期研究发现法尼基转移酶作用KCs后，导致KCs中MVA累积，CH合成减少, KCs增殖抑制[1]；本研究发现当RO与CH联合作用于KCs后，CH可部分削弱RO对KCs的增殖抑制作用，该结果表明RO可能通过减少下游CH的合成，进而导致KCs细胞基因水平的改变，影响细胞增殖。因此,KCs的增殖是一个是由许多分子调节的复杂过程。本研究的结果部分解释了甲羟戊酸途径功能障碍所致的KCs增殖抑制机制。
综上所述,R0引起KCs甲羟戊酸途径代谢紊乱,KCs细胞周期和周期蛋白发生了变化，并抑制KCs的增殖。因此，有效地调节甲羟戊酸途径顺利进行对KCs的增殖至关重要。为研究汗孔角化症等皮肤疾病发病机制提供了一定的理论基础。
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Effects of lanosterol synthass inhibitor RO on proliferation of keratinocytes
麦博fc330Lin Li,Gu Yannn,Zhou Hony,q ai
(Centes fxs Scientifit Researd of AnJiit Medical University,Hefei230034)
Abstract Objective Tv inveshpaiv tha ebeci of RO vs combineb cOo/sterol(CH)on neratinocytvs celi prolifergi tion ank cyclin expression0Methods Tha KCs were0—0x5with diNereni conceptrations of RO fas diNereni U nvs, tha proliferation of KCs were analyzeb by MTS.Celi cyciv of KCs were detecteb by flow cytometra aftas usiny RO with diNereni tixas vs combineb treateb with CH,end Western blvi wns useb ti reveai tha expression of CychnBl ank CyclinE.Results Tha RO inkipiteb tha proliferation of KCs in n quantitativa ank tiNv-6ebebkeni manes. Combineb use of CH reXueeb ihv proliferation inkibitNn of RO on KCs.RO cop IV sipnificyntiy increase-ha pmpasi tion of KCs cell cyciv in G1phdso,whiia combineb use of CH rebucep G1pPaso510x1-1raia of KCs cell cycla. Western blvi demonstrateb thni use of RO could rebucep tha CyclinB1ank CyclinE contexi in tha KCs in n tima dpi pebkexca manes.Combineb use of CH antaaopism RO down-requlateb Cyclin E,but hnO nv sipnificy
nt ebeci on tha expression of CychnB1.Codclusiod RO inkibits tha proliferation of KCs by down-requlatiny iha expression of CyclinB1ank CyclinE which b/chs tha G1pPaso of KCs cell cycla.
Key worOs RO;CH；KCs;cell proliferation;cyclins
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