ә
通信作者,E -m a i l :j i a n g x i a o f e n g
12359@163.c o m ㊂ 本文引用格式：金陈飞，崔梦竹，梁红艳，等.液相谱-串联质谱法检测类固醇激素在C A H 筛查中的应用进展[J ]. 国际检验医学杂志,2021,42(7):881-885.
㊃综 述㊃
液相谱-串联质谱法检测类固醇激素在C A H 筛查中的应用进展
金陈飞，崔梦竹，梁红艳，姜晓峰ә
哈尔滨医科大学附属第四医院检验科，黑龙江哈尔滨150028
生物学教学
摘 要：准确测定先天性肾上腺皮质增生症(C A H )
患者体内的各激素水平一直是困扰检验工作人员的难题㊂液相谱-串联质谱法(L C -M S /M S )是目前公认的具有较大应用潜力的检测方法㊂本文从C AH 患者的类固醇激素代谢情况,L C -M S /M S 检测类 固醇激素的方法学建立要点及L C -M S /M S 用于C A H 诊治的研究现状
进行综述，明确了L C -M S /M S 有避免非特异性物质干扰，解决免疫分析法的高假阳性，检测标本多样化及能够快速进行类固醇代谢谱分析的优点，是一种能够为临床内分泌疾病的诊断与疗效监测提供精准㊁高效的检测手段㊂同时本文也对此检测技术的不足进行了阐述㊂
关键词：液相谱-串联质谱法; 免疫分析法; 先天性肾上腺皮质增生症; 类固醇激素
D O I :10.3969/j
约翰邓恩.i s s n .1673-4130.2021.07.027中图法分类号:R 586.9
文章编号:1673-4130(2021)07-0881-06
文献标志码:A
A d v a n c e s i n t h e a p p l i c a t i o n o f l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y -t a n d e m m a s s s p e c t r o m e t r y
i n t h e d e t e c t i o n o f s t e r o i d h o r m o n e s i n C A H s c r e e n i n g
J I N C h e n f e i ,C U I M e n g z h u ,L I A N G H o n g y a n ,J I A N G X i a o f e n g
ә
D e p a r t m e n t o f C l i n i c a l L a b o r a t o r y ,t h e F o u r t h A f f i l i a t e d H o s p i t a l o f H a r b i n M e d i c a l U n i v e r s i t y ,
H a r b i n ,H e i l o n g j i a n g 1
50028,C h i n a A b s t r a c t :A c c u r a t e d e t e r m i n a t i o n o f t h e l e v e l s o f v a r i o u s h o r m o n e s i n p a t i e n t s w i t h c o n g e n i t a l a d r e n a l h y
-p e r p l a s i a (C A H )h a s a l w a y s b e e n a n i m p o r t a n t i s s u e t h a t p l a g u e s l a b o r a t o r y w o r k e r s .L i q u i d c h r o m a t o g
r a -p h y -t a n d e m m a s s s p e c t r o m e t r y (L C -M S /M S )i s c u r r e n t l y r e c o g n i z e d a s a d e t e c t i o n m e t h o d w i t h g r e a t a p p
l i -c a t i o n p o t e n t i a l .T h i s a r t i c l e r e v i e w s t h e s t e r o i d h o r m o n e m e t a b o l i s m o f p a t i e n t s w i t h C A H ,L C -M S /M S
m e t h o d o l o g i c a l e s t a b l i s h m e n t p
o i n t s f o r s t e r o i d h o r m o n e d e t e c t i o n ,a n d t h e c u r r e n t r e s e a r c h s t a t u s o f L C -M S /M S i n t h e d i a g n o s i s a n d t r e a t m e n t o f C A H.I t i s c l e a r t h a t L C -M S /M S h a s t h e a d v a n t a g e s o f a v o i d i n g n
o n -s p e c i f i c i t y .T h e a d v a n t a g e s o f s u b s t a n c e i n t e r f e r e n c e ,r e s o l u t i o n o f h i g h f a l s e p o s i t i v e s o f i mm u n o a s s a y
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s i s o f s t e r o i d m e t a b o l i s m p r o f i l e s a r e a k i n d o f a c c u r a t e a n d e f f i c i e n t d e t e c t i o n m e t h o d s t h a t c a n p r o v i d e a c c u r a t e a n d e f f i c i e n t d e t e c t i o n m e t h o d s f o r c l i n i c a l e n d o c r i n e d i s e a s e d i a g
-n o s i s a n d e f f i c a c y m o n i t o r i n g .A t t h e s a m e t i m e ,t h i s a r t i c l e a l s o e l a b o r a t e d o n t h e s h o r t c o m i n g
愉悦和痛苦
s o f t h i s d e t e c -t i o n t e c h n o l o g y
.
K e y w o r d s :l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y -t a n d e m m a s s s p e c t r o m e t r y ; i mm u n o a s s a y ; c o n g e n i t a l a d r e n a l h y -p e r p
l a s i a ; s t e r o i d h o r m o n e s 先天性肾上腺皮质增生症(C A H )是一组由于类固醇激素合成代谢中某种酶缺乏导致皮质醇合成障碍为主要特征的常染体隐性遗传病，会导致肾上腺皮质生成类固醇激素的水平发生改变，并且根据疾病分型不同，激素水平变化有明显差异㊂ 类固醇激素又称为甾体激素，是胆固醇经一系列酶催化而来的高效能物质，主要分为肾上腺皮质激素㊁性激素和维生素D ㊂各种类固醇激素在体内水平极低，一般检测水平在n m o l /L 或p m o l /L 数量级,
因此寻一种可靠㊁特异的分析方法成为临床疾病诊断的首要任务㊂
fla格式
目前类固醇激素的检测手段主要包括放射免疫分析技术㊁化学发光免疫分析技术㊁酶联免疫吸附测
定㊁气相谱质谱分析法㊁液相谱-串联质谱法(L C -
M S /M S )等[1-2]
㊂免疫分析法具备操作简单㊁快速的优点，然而R A UH [3]研究显示,
免疫分析法灵敏度较低，易引起交叉反应造成假阳性，无法同时检测同一
标本中的多种激素水平，无法实现类固醇代谢谱的高
㊃
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r i l 2021,V o l .42,N o .7
效㊁深入㊁准确的研究㊂W I L S O N等[4]研究表明，孕酮测定受不同类固醇(包括17α-羟孕酮㊁11-去氧皮质酮㊁20-二酮)所引发的高达10%的交叉反应影响，导致免疫检测结果偏高㊂而L C-M S/M S凭借高通量㊁灵敏度高㊁特异度高㊁检测标本多样㊁检测动态范围宽等优势在C A H临床诊断中的地位越来越重要[5]㊂1 C A H类固醇激素代谢通路及主要的C AH分类
C A H是肾上腺皮质功能减退较常见的原因之一㊂根据酶缺乏将C A H分为7型，具体各型详见表1，不同酶缺陷时呈现不同的生化和临床表现㊂肾上腺皮质类固醇激素合成代谢途径见图1㊂
表1常见临床C A H分型
C A H分型占比基因分类升高的激素降低的激素临床表现参考文献
21-羟化酶缺乏
症(21-O H D)近95%C Y P21A2失盐型㊁单纯男性
化型㊁非经典型
17-羟孕酮㊁孕酮㊁
雄烯二酮㊁睾酮㊁
脱氢表雄酮
马洪老酒醛固酮㊁11-脱氧
皮质醇㊁皮质醇
失盐型：新生儿期肾上腺危象，表现为
喂养困难㊁发育不良㊁呕吐㊁脱水㊁高钾
血症㊁低钠血症㊁代谢性酸中毒
单纯男性化型：女性外生殖器的男性
化㊁假性早熟㊁身高增加㊁骨龄超前
非经典型：女性患者在出生时生殖器
正常或轻度男性化㊁男性和女性患者
在青春期前晚期出现耻骨和肾上腺
早熟
[6]
11β-羟化酶缺乏
症(11β-O H D)约5%~8%C Y P11B1经典型㊁非经典型17-羟孕酮㊁孕酮㊁
11-脱氧皮质醇㊁
11-去氧皮质酮㊁
雄烯二酮㊁睾酮㊁
脱氢表雄酮㊁促肾
上腺皮质激素
皮质醇㊁皮质酮㊁
醛固酮
经典型：女性严重男性化㊁两性性早
熟㊁生长加速和骨骼成熟㊁高血压㊁低
钾血症
非经典型：轻度多毛和月经不调
[7]
3β-羟类固醇脱氢酶2型缺乏症(3βH S D2D)低于0.5%H S D3B2
失盐型㊁男性不完
全男性化型㊁女性
男性化型㊁非经典
型
脱氢表雄酮㊁促肾
上腺皮质激素㊁肾
素㊁Δ5-类固醇与
Δ4-类固醇的比
值㊁Δ5-17-羟基孕
烯醇酮
皮质醇㊁醛固酮㊁
雄烯二酮㊁17-羟
孕酮㊁孕酮㊁睾酮
失盐型：低钠血症㊁高钾血症㊁代谢性
酸中毒和低血糖
男性不完全男性化型：尿道和阴囊唇
皱褶的融合㊁严重的尿道下裂㊁小阴
茎㊁阴囊裂和隐睾
女性男性化型：增大㊁唇融合不完
全㊁生殖器素沉着
非经典型：儿童阴毛发育过早㊁女性
多毛及月经不调
[8]
17α-羟化酶缺乏
症(17α-O H D)1%C Y P17A1-醛固酮㊁皮质酮㊁
促肾上腺皮质激
素
皮质醇㊁雌二醇㊁
睾酮
高血压㊁低钾血症㊁男性假两性畸形和
女性性腺发育不良㊁缺乏青春期
[9]
侧链裂解酶缺
乏症(S C C)-C Y P11A1经典型㊁非经典型肾素-经典型：表型女性，新生儿失盐
非经典型：肾上腺功能不全，生殖器和
性腺功能变化
[10]
细胞素P450氧化还原酶缺乏症(P O R D)-P O R-
孕烯醇酮㊁孕酮㊁
17-羟孕酮㊁21-脱
氧皮质醇㊁皮质
酮㊁11-去氧皮质
酮
睾酮㊁二氢睾酮
生殖器发育不全㊁骨骼畸形㊁少或闭
经㊁不孕㊁先天性男性化
[11]
先天性脂肪样
肾上腺增生症(C L A H)-S t A R经典型㊁非经典型肾素-
经典型：表型女性，新生儿失盐
非经典型：肾上腺功能不全，生殖器和
性腺功能变化
[10]
注:-为该项无数据㊂
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图1 肾上腺皮质类固醇激素合成代谢途径
21-O H D 是C A H 中最常见的类型,
临床可分为3型,
分别为失盐型㊁单纯男性化型及非经典型㊂在肾上腺皮质类固醇激素合成代谢途径中,21-
羟化酶催化17-羟孕酮转化为11-脱氧皮质醇和催化孕酮转化为11-去氧皮质酮，两者分别为皮质醇和醛固酮的前体㊂因此,C A H 患者类型为21-O H D 时皮质醇和醛固酮有不同程度的合成不足或完全缺乏，同时上游底物(17-羟孕酮和孕酮)水平因堆积而明显升高，因此,17-羟孕酮水平显著升高成为诊断21-O H D 最有意义的指标，临床通常根据17-羟孕酮水平的改变评估效果㊂因此,17-羟孕酮已被大多数国家纳入新生儿筛查项目，这有助于快速检测出21-O H D 患儿㊂然而该项检查受到较多因素干扰造成检测结果假阳性高㊂由于脐带血中17-羟孕酮水平很高，所以新生儿在出生1~2d 内17-羟孕酮往往高于临界值，并逐渐下降㊂此外，早产儿和许多因其他疾病引起生理应激的足月婴儿中,17-羟孕酮水平往往比实际水平高，筛查测试的阳性预测值在早产儿中仅为0.4%，而在足月儿中为30.1%
[12-13
]，因此建议对所有17-
羟孕酮水平升高的新生儿在1个月后进行第2次L C -M S /M S 筛查㊂
11β-O H D 的主要生化异常为低血钾，但是严重度因基因突变类型而异，甚至可出现血钾正常的情况㊂其他生化指标变化体现在血17-羟孕酮㊁雄烯二酮㊁脱氢表雄酮水平升高，血清皮质醇㊁醛固酮水平降低，血肾素活性减低㊂此外，该症的特征性指标是血和
尿11-脱氧皮质醇和去氧皮质酮水平升高，尿中二者的主要代谢产物四氢11-脱氧皮质醇及四氢去氧皮质酮水平升高，这是与21-O H D 进行鉴别的关键指标㊂
2 L C -M S /M S 法检测类固醇激素方法学的建立
目前检测类固醇激素的生物标本主要有血清㊁血
浆㊁毛发[14]㊁尿液[15]㊁唾液[16]㊁子宫内膜[17]
等㊂在方
法开发建立的过程中可通过以下几个步骤提高检测
性能㊂(1)标本处理：良好的标本前处理方法可以起到富集目标组分㊁消除或降低基质干扰㊁提高灵敏度的作用，反之则会容易引入误差并延长分析时间㊂目前血液中类固醇激素的前处理方法有蛋白质沉淀㊁液液萃取和固相萃取，而多种前处理方法相结合具有低基质效应㊁回收率高㊁灵敏度高㊁自动及快速等优点,
已逐渐受到临床关注[18]
㊂(2)
检测过程：要针对检测项目的特点选择合适的谱柱㊁流动相流速㊁离子源和质量分析器，类固醇激素检测通常与三重四级杆质量分析器或三重四级杆串联线性离子阱质量分析器串联，采用电喷雾离子源或大气压化学电离源，并利用多反应监测模式对靶向代谢组进行分析，按离子质荷比的大小顺序进行收集和记录，进而得到质谱图用于结果分析㊂为了避免内源性或外源性基质物质的干扰，降低待测物信号的损失和信号波动，可在同一批分析中的所有标本中加入等体积的内标液，绝大部分待测物的信号波动和量的损失都可以得到校正㊂内标通常分为2型，即结构类似物内标和同位素标记内标，在类固醇激素检测时常常选择同位素标记内
标[19]
㊂新生儿筛查C A H 时常常检测的激素与相应
内标检测信息见表2㊂同时为确保准确度及批间或批内精密度，每次测量时均应准备质控品㊂(3)数据处理：合理的分析方式能为实验研究提供更加精准的结果，保证结果的可靠性㊂质谱数据处理一般采用质谱仪对应的数据处理软件，用空白提取液配制标准品做标准曲线，有效排除干扰因素，可以保证高通量㊁高准确性的数据处理㊂
表2 新生儿筛查C A H 时常检测的激素与相应内标
激素
/内标名称分子式
相对分子
质量(ˑ103
)
离子模式
Q 1Q 3前处理方式提取试剂
是否衍生化/衍生化试剂参考文献孕酮
C 21H 30O 2314.46E S I (+)315.297.1
蛋白质沉淀+液液萃取+衍生化乙腈+甲基叔丁基醚
是/异烟酸酰氯+二氯甲烷[20]孕酮-d 9C 21D 9H 21O 2323.52E S I (+)324.1100.1蛋白质沉淀+液液萃取+衍生化乙腈+甲基叔丁
基醚
是/异烟酸酰氯+二氯甲烷[20]17α-羟孕酮C 21H 30O 3330.46E S I (+)331.497.1
固相萃取乙腈+水
否[21]17α-羟孕酮-d 8C 21H 22O 3D 8338.51E S I (+)339.4100.1固相萃取乙腈+水
否[21]雌酮C 18H 22O 2
270.37E S I (+)270.4171.1液液萃取1-氯丁烷否[22]雌酮-d 4
C 18
D 4H 18O 2
274.39
E S I (+)
274.4
171.1
液液萃取
1-
氯丁烷否
[22
]㊃
388㊃国际检验医学杂志2021年4月第42卷第7期 I n t J L a b M e d ,A p
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续表2 新生儿筛查C A H 时常检测的激素与相应内标
激素
/内标名称分子式
相对分子
质量(ˑ103
)
离子模式
Q 1Q 3前处理方式提取试剂
是否衍生化/衍生化试剂参考文献脱氢表雄酮
C 19H 28O 2288.42A P C I (+)394.3124.0蛋白沉淀+液液萃取+固相萃取乙腈+甲醇否
[23]脱氢表雄酮-d 6C 19D 6H 22O 2294.46A P C I (+)400.3124.0蛋白沉淀+液液萃
取+固相萃取乙腈+甲醇
否
[23]皮质醇
C 21H 30O 5362.47E S I (+)363.3121.1蛋白质沉淀+固相萃取
丙酮+乙腈+甲酸
+甲醇否
[24]皮质醇-d 4C 21H 26D 4O 5366.48E S I (+)365.3121.1蛋白质沉淀+固相萃取
丙酮+乙腈+甲酸+甲醇
否[24]醛固酮C 21H 28O 5
360.44E S I (+)474.3415.2固相支持液液萃取乙腈+甲酸否[25]醛固酮-d 7
C 21
D 7H 21O 5
367.49
E S I (+)
482.4
423.2
固相支持液液萃取
乙腈+甲酸
否
[25
] 注:Q 1为前体离子;Q 3为产物离子㊂
为了确保检测结果准确可靠,
需要对检测方法进行性能评估，主要包括检测下限与定量下限㊁精准度㊁线性关系㊁选择性㊁稳定性㊁准确度㊁表观回收率㊁基质
效应等㊂T R A V E R S 等[26]
www.902007建立了L C -M S /M S 检测
血清中15种类固醇激素的方法,
采用蛋白质沉淀和固相萃取相结合的方法提取血清甾体化合物和氘化内标物，回收率从21-脱氧皮质醇的64%到皮质醇的101%不等，并与免疫分析法比较,2种方法检测皮质
醇，脱氢表雄激素和睾酮的结果较一致，免疫分析法
检测醛固酮数值偏低，孕酮水平低于2n g /m L 的17-羟孕酮㊁雄烯二酮和11-
脱氧皮质醇水平明显偏高㊂分析这种差异产生的原因:(1)免疫分析法抗体特异性低导致的交叉反应，例如来自胎儿肾上腺区的类固醇单硫酸盐，主要是17-羟基孕烯醇酮硫酸盐导致免疫测定中17-羟孕酮水平错误升高[27
];(2)L C -M S
/M S 在提取过程中加入了内标液,
可以有效提升检测特异性㊂
3 L C -M S /M S 在C A H 诊断中的应用现状
新生儿筛查目的在于在症状出现之前尽早发现并准确诊断C A H 等先天性疾病，而通常所用的免疫分
析法(一级筛查)常常出现假阳性，增加了患者的心理负担和经济压力㊂2018年由美国内分泌学会专家组发布的21-O H D 临床实践指南(第二版)与2010年发布的第一版指南比较，新增新生儿筛查时推荐一级筛查采用常规方法检测17-羟孕酮，并推荐了优先采用L C -M S /M S 进行二级筛查,
不推荐其他方法(如基因分型)，以此提高C A H 筛查的阳性预测值
[28-29]
㊂S C HWA R Z 等[30
]发现C A H 患病率和血清17-
羟孕酮水平随着新生儿体质量增加而降低，皮质醇的水平随采样时年龄不同而发生明显变化，未观察到17-羟孕酮或雄烯二酮与年龄有明显相关性㊂值得注意的是雄烯二酮是较敏感的雄激素，并且其水平较17-羟孕酮稳定，且受皮质醇替代时给药间隔时间的影
响较少，也不受性别㊁疾病类型和抽血时间的影响，与17-羟孕酮有较好的相关性㊂在这项研究中作者证实(17-羟孕酮+雄烯二酮)/皮质醇是C AH 的最佳判别方法，但若二者比值大于4时需注意是否在采样之前使用了糖皮质激素类药物，避免假阴性结果的发生㊂2010年欧洲内分泌协会临床指导委员会制订的
21-O H D 临床应用指南[28]
指出经典型C A H 患者17-羟孕酮水平通常高于300n m o l /L ，非经典型C A H 患
者17-羟孕酮水平在6~300n m o l /L ，当17-O H P <6
n m o l /L 时不支持C A H 诊断㊂因此根据17-羟孕酮检测水平对C A H 疾病准确分型,
进而辅助临床精准具有重要意义㊂AM B R O Z I A K [31]
等证明了与L C -
M S /M S 比较，免疫分析法检测17-羟孕酮可能会增加非经典型C A H 假阳性诊断的风险㊂由此可见,L C -M S /M S 检测17-羟孕酮在C A H 诊断分型中具有重
要意义㊂
目前，临床多将17-
羟孕酮水平是否升高作为新生儿筛查时判断是否患21-O H D 的首要指标，但表1中其他形式的C A H 也可能导致检测到17-羟孕酮水平升高[32]
㊂由图1可看出21-O H D 患者缺乏21-
羟化酶会使17-羟孕酮的下游产物11-脱氧皮质醇水平降低,21-
脱氧皮质醇水平升高㊂因此，有研究者提出21-脱氧皮质醇作为21-O H D 的另一标志物，那么21-脱氧皮质醇是否可以在一定程度上取代17-羟孕酮在21-O H D 诊断中的地位有待研究㊂J A N Z E N 等
[33]
建立的L C -M S /M S 不仅避免了免疫分析法诊断C A H
时的假阳性高的问题，还发现可以通过计算(17-羟孕酮+21-脱氧皮质醇)/皮质醇的数值进一步提高L C -
M S /M S 的灵敏度，在242500例新生儿中,1609例
初筛试验阳性，而通过计算确定了其中已确诊的16例21-OH D 患者，没有误报㊂由此可见，在二级筛查时可更多关注21-脱氧皮质醇的水平变化，并且选择合适的计算公式来提高检测方法的灵敏度，这也为
㊃
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C A H的诊断提供了新思路㊂
4结论
综上所述，类固醇激素水平精准定量检测对于C A H的诊断和确切分型具有重要意义㊂L C-M S/M S 最主要的优势就是高通量㊁灵敏度高㊁特异性强㊁检测标本多样㊁检测动态范围宽等，目前有望取代免疫分析法㊂但由于L C-M S/M S标本处理操作复杂，自动化程度较低，需要操作人员进行规范化培训才可应用于临床㊂因此，简化标本处理操作流程㊁实现全自动化是目前面临的挑战，也是研究的焦点㊂
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㊃588㊃
国际检验医学杂志2021年4月第42卷第7期I n t J L a b M e d,A p r i l2021,V o l.42,N o.7
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