农业生物技术学报 Journal of Agricultural Biotechnology2007,15(2):207~211
*基金项目： 国家自然科学基金项目(No.30270955)； 西农博士启动基金(2004博01)资助。
**通讯作者。 Author for correspondence.教授， 主要从事生殖生理和生殖内分泌研究。Email： <j.zhang@swau.edu>.收稿日期： 20060724接受时期： 20060831·研究论文·
王鲜忠， 孙 燕， 吴建云， 罗 英， 贾孙涨， 胡淮杰， 张家骅 **
（西南大学动物科技学院， 重庆市牧草与草食家畜重点实验室， 重庆 400716）
摘要：不同发育阶段， 睾丸合成睾酮的能力差异很大。为了阐明引起睾酮合成差异的分子机制， 实验以不同年龄的 SPF昆 白小鼠 ，采用 RTPCR与Western blot分析了不同年龄阶段类固醇合成酶的变化。结果显示：（1） 在不同年龄阶段， （胆 固醇支链裂解酶） mRNA、 （3β 羟胆固醇脱氢酶） mRNA、 （类固醇合成快速调节蛋白） mRNA和蛋白的水平无明 显变化；（2） （C 1720裂解酶） mRNA的表达水平在 30、 60和 120d均处于较高的水平， 但是在 270d则处于较低的水平； （3） 30~270d， 细胞外信号调节激酶(ERK)活性无明显变化。表明， mRNA表达差异可能导致不同时期睾酮合成能力差 异的重要原因， 但ERK活性可能与衰老引起睾酮合成能力下降无直接关系。
关键词：睾丸； 类固醇合成;小鼠； 年龄
中图分类号： S188 文献标识码： A 文章编号： 10061304(2007)02020705
Changes of the Ability of Testosterone Synthesis in Mouse Testis of Different Periods
WANG Xianzhong,SUN Yan,WU Jianyun,LUO Ying,JIA Sunzhang,HU Huaijie,ZHANG
Jiahua**
To study the mechanism of changes of the ability of testosterone synthesis in different periods,Kunbai mouse in different periods were used as experimental animals.The ability of testosterone synthesis was analyzed by RTPCR and Western blot.The results were as followed:(1)In all periods,the expression of cholesterol side chain decomposition enzyme( ),3betahydroxysteroid de hydrogenase( )， steroidogenic acute regulatory protein(StAR)mRNA and protein had no significant change.(2)The levels of cy tochrome P45017alphahydroxylase( )mRNA were high in10,60and120d.However,that of mRNA decreased sig nificantly in270d.(3)From30d to270d,the activity of extracellular signal regulated kinases(ERK)had no significant change.These re sults inferr
ed that the difference of the level of mRNA was an important factor of the difference of the level of testosterone,but
the activity of ERK had no direct relation with the decrease of mRNA and the level of testo
sterone
testis;steroidogenesis;mice;age
睾酮具有维持生精作用、 刺激生殖器官发育、 维 持正常性欲和促进蛋白质合成的生理作用（王启荣 和杨则宜， 2004）。在睾丸中， 睾酮由 Leydig细胞合 成分泌，作为类固醇合成前体的胆固醇首先在类固 醇合成快速调节蛋白(StAR)的作用下由线粒体外膜 转移到内膜，再经胆固醇侧链裂解酶(P450scc)、 3茁 羟甾脱氢酶 (3茁 HSD)、 17琢 羟化酶 (P450c17))和 17羟甾脱氢酶(17β 3HSD)等酶的催化作用生成 睾酮。 睾酮生成过程受到多种因素的调节， 在不同发 育阶段睾酮水平也不相同 （祝辉等， 2004）。 仔猪睾丸 发育过程中， 间质细胞产生的睾酮有 3个高峰期， 即 胚胎性别分化前后、 出生前后和初情期前后， 这 3个 时期分别诱导雄性器官的分化和发育、中枢神经系 统下丘脑雄性化和雄性第二性征的形成（Rene .， 2001）。 随着年龄的增长， 睾丸合成睾酮的能力开 始下降，
在老年男性可出现血清总睾酮(T)、 游离 T 和生物可利用 T水平逐渐降低（邵迎红 等， 2004）。 Martinelle（2004） 发现在未成年大鼠中， 活化的 细胞外信号调节激酶(ERK)也能促进 StAR的表达， 蛋白激酶 A（PKA） 和蛋白激酶 C（PKC） 的激活是 ERK活化的上游事件。 ERK在不同时期的睾丸中的 活性如何， 以及活性变化与睾酮合成的相互关系， 目
农 业 生 物 技 术 学 报 2007年
表 1引物序列和参数
Table1Primer sequences and parameters
基因名称 Gene 引物序列
Sequence of primer
F:GTGGGGCGCCCCAGGCACCA
R:CTTCCTTAATGTCACGCACGATTTC
F:ATGCTGGAGGAGACGGTGGACCCCG
R:GGTGTATTTGTCGGCGTTG
F:TGGTGACAGGAGCAGGA
R:AGGAAGCTCACAGTTTCCA
F:GCCTGACAGACATTCTG
R:TCGTGATGCAGTGCCCAG
F:5′ TGAGCCCTTTCGTGTCTA3′
R:5′ CCAGCAGTTTTTCCTTTG3′
退火温度/℃
功能减退Temperature
60
58
55
55
考考你的智商
58
循环数
Number of cycles
30
35
30
30
30
产物大小 /bp
Amplified product
540
138
891
406
445
前还不清楚。为了阐明在不同时期睾酮合成能力的 变化，本实验利用 RTPCR和 Western blot分析了 不同时期睾丸中睾酮合成相关酶和调节因子的变 化，并分析了 ERK活性的变化。
1材料和方法
牧一征1.1 材料和主要仪器
RIPA(radio immunoprecipitation assay)裂解液 （北京百泰克生物技术有限公司）、 EGTA(ethyleneg lycol bis(2aminoethyl ether)tetraacetic acid)（San landChem International Inc，美国）、 PMSF(phe
nyl methyl sulfonylfluoride)（Genview， 美国） 、 Trypsin In hibitor（Sigma） 、 抗 pERK(E4)(phosphorylationex tracellular signalregulated kinases， 小鼠单克隆抗体， 针对包含有 Try204磷酸化的一个片段， 用于大鼠、 小鼠和人，可识别 Try204磷酸化的 ERK1和 ERK2)和 ERK（extracellular signalregulated kinases， 兔多克隆抗体，针对 ERK1编码的 MAP激酶 P44， 识别 ERK1P44，与 ERK2P42有交叉反应）抗体 （SantaCruz）。逆转录试剂盒（ReverTra Ace琢 ， TOYOBO）、 DNA聚合酶和 DNA marker均为 Promega产品， 预染 marker（MBI）。StAR蛋白抗体 由 Stocco DM教授 （Texas tech University Science Center,Texas） 馈赠。 雄性 SPF级昆白小鼠， 购于重庆 中医药研究所。FR200A全自动电动玻璃匀浆机购 于上海复日科技， DY891型电动玻璃匀浆机购于宁 波新芝生物科技股份有限公司， Touchgene Gradient PCR购于 TECHE。
1.2 方法
1.2.1 RNA和蛋白的提取 分别选取 30、 60、 120和 270d的 SPF级昆白小鼠各 10只，脱颈处死小 鼠， 无菌条件下收集睾丸， 称重， 并将左右睾丸随机 分装在两支 10mL的 EP管中， 分别用于提取 RNA 和蛋白质。提取 RNA时， 根据睾丸质量加入适量的 Trizol， 在玻璃均浆机上匀浆。加等体积氯仿， 轻摇， 室温静置 2~3min后， 4 ℃， 12000r/min离心 15 min。然后取上清无水相到经 DEPC处理过的 EP 管， 加异丙醇 2.5倍， 沉淀 RNA。室温放置 10min。 2～8 ℃， 12000r/min离心 10min，去上清，加 0.5 mL75%乙醇，洗涤沉淀， 4 ℃， 7500r/min离心 5 min。重复上述步骤 2～3
次； 沉淀放置表面皿中阴 干。加入 30滋 L DEPC处理的 ddH2 O溶解， －80 ℃保存待用。 将提取的 RNA取 1滋 L， 在紫外分光光度 计上测定 RNA浓度， 当 1.8< 260/280 =2.0时符合要 求。另取 2滋 L RNA用于 1%的琼脂糖凝胶电泳。
提取蛋白时按 300mg组织加入 1mL冰冷的 RIPA缓冲液，同时加 30滋 L PMSF(10mg/mL)， 250滋 L Trypsin Inhibitor（1mg/mL）， 80滋 L EGTA（pH 8.0）（0.5mol/L） 在玻璃均浆机上匀浆， 所有步骤均 在 4℃下进行。匀浆后冰上放置 30min， 4 ℃， 10 000r/min离心 10min， 取上清， －20 ℃备用。
1.2.2 RTPCR逆转录用 Oligo(T)1滋 L， 在 RNA 3滋 g,dNTP2滋 L,Rnasin1滋 L,RT酶 1滋 L的条件 下， 按 30 ℃10min， 42 ℃20min，99 ℃5min，4 ℃5 min进行逆转录， 获得第 1链。
1.2.3 PCR按 cDNA2滋 L， DNA聚合酶 0.01 U/滋 L， dNTP50滋 mol/L， 选定引物(2滋 mol／L)， 反 应体系为 25滋 L。产物在 1.2%的琼脂糖凝胶电泳。 根据 GenBank中的序列设计 （S59219）、 （BC064793.1）、 （NM012584.1）和 （AY368628） 的引物， 经经测序证明与预期序 列相符合， 由鼎国公司提供，其它引物由上 海生工生物工程技术服务有限公司合成。实验结果 经凝胶成像系统结合 Quanity one进行光密度分析， 用 作为内参， 分析各个基因表达的变化。所 用引物的参数如表 1。
1.2.4 Western blot用 Bradford法测定蛋白浓 度， 每孔上样量 40滋 g。 按浓缩胶浓度为 5%， 分离胶
208
第 2 期 王鲜忠等: 不同时期小鼠睾丸合成睾酮能力的差异 浓度为 12%制胶。按浓缩胶 20mA ， 电泳 1.5h ； 分 离胶 40mA ， 电泳 3～4h 。在电压为 90V 条件下转 移 2h，抗 StAR 蛋白、 抗 pERK(E4)和抗 ERK 抗体 浓度均为 1颐 500， 二抗浓度为 1颐 5000， 用 DAB 进行 显， 数码拍照并用 Quanity one 进行光密度分析。 1.3 统计分析
每个实验重复 3 次， 每组数据用 ( 依 )表示， 用 SPSS10.0 以 Oneway ANOVA 评价组间差异。
2 结果
2.1 不同时期睾丸中类固醇合成酶和 mRNA
表达的变化
从图 1 看出，不同时期的小鼠睾丸中，尽管
mRNA 、 mRNA 和 mRNA 的
表达水平有一定的变化，但均无统计学上的差异 ( ＞0.05)； 但就 而言， 在 30、 60 和 120d 的
睾丸中，
其 mRNA 处于一个较高的水平， 而在 270d 时， 则明显低于其它时期 （ <0.05）。
2.2 不同时期睾丸中 StAR 蛋白水平的变化
从图 2 看出，尽管在 4 个时期 StAR 蛋白的水 平有一定差异， 但变化不明显 （ >0.05）。 2.3 不同时期睾丸中 ERK 活性的变化
从图 3 看出, 睾丸中 ERK 的活性在在 30、 60、 120 和 270d 尽管有一定的差异，
但变化不大， 差异 不显著 （ <0.05）。
3 讨论
睾酮的生物合成是一个受多种因素调节的酶促 反应过程，各种酶和调节因子的表达与睾丸的发育
阶段有着十分密切的关系。睾酮的生物合成起始于 胆固醇的转运， StAR 蛋白参与了这一过程。从妊娠 期中期开始， 胎儿的睾丸开始表达 StAR 蛋白， 这与 胚胎性分化过程中，睾丸的发育必须依赖睾
酮的作 用有关
（Sriraman .,2003）
。 王鲜忠等 （2003） 利用 免疫组化研究发现，在 1~5 周龄， StAR 蛋白主要在 仔猪睾丸的间质细胞中表达；其中 1、 3 周龄 StAR 蛋白的表达水平较低， 2、 4 周龄表达水平较高， 5 周
图1.不同时期睾丸中类固醇合成酶和 mRNA 表达的变化
Fig.1.Effect of ages on the expression of steroidogensis enzymes and mRNA
A .Electrophoresis of different genes ；
B Relative intensity of the expressing level of different genes.1， 30d ； 2， 60d ； 3， 120d ； 4， 270d;Mmarker
图 2.不同时期小鼠睾丸 StAR 蛋白水平的变化 Fig.2.Concentration of StAR protein in different periods
A.Western blot of StAR protein;
B.Arbitrarily
densitometric units of the expressing level of StAR protein.1， 30d;2， 60d;3， 120d;4， 270
d;M,
marker .
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农 业 生 物 技 术 学 报 2007年
图3.不同时期睾丸中 ERK活性的变化
Fig.3.Change of he activity of ERK in testis of different peroid
A.Western blot of ERK and proERK；
B.Relative intensity of ERK.
1,30d； 2,60d； 3,120d； 4,270d.
龄表达水平低于 2、 4周龄，但比 l、 3周龄强。 LeersSucheta（1999） 的研究发现， 用 hCG刺激
的体外培养的老年 SD大鼠睾丸间质细胞， StAR蛋 白表达水平明显低于青年大鼠。老年棕挪威大鼠 (BN)睾丸间质细胞 mRNA和蛋白表达均降 低， 虽然 LH刺激后 mRNA和蛋白水平升高， 但仍显著低于 LH刺激后青年大鼠水平 （Luo , 2001）。 邵迎红 等（2004） 的结果显示， 在基础状态和 hCG刺激后，老年 SD大鼠睾丸 mRNA水平 与青年 SD大鼠无显著差异， 并认为老年雄性 SD大 鼠血清 T水平降低可能并非由于 StAR产生减少所 致。本实验结果显示， 不同时期， mRNA和蛋 白水平没有明显差异， 支持邵迎红 等（2004） 老年睾 酮水平下降与 StAR产生减少无关的论点， 但测定 4个时期 StAR蛋白的表达无明显变化可能与本实验 材料的时期有关， 因为 30d小鼠， 其睾丸的功能基 本成熟， 此时 StAR蛋白的表达与成年无明显差异。
P450scc和 P450c17属于细胞素 P450家族 的成员， 二者均是单一基因的产物， 其中 P450scc与 线粒体内膜相连， 而 P450c17位于内质网中， 在睾丸 中， P450scc和 P450c17仅在间质细胞中表达， 并且 均受到 SF1的调控， 尽管二者表达均受到 cAMP的 调控，但仅有 P450c17完全受 cAMP刺激的控制 （Payne and Youngblood,1995， Payne and Hales, 2004； Waterman,1994）。小鼠妊娠后 12d， 用原位杂 交能在胚胎睾丸间质检测到 P450scc；用 RTPCR
在 13d就能在胚胎睾丸检测到睾酮合成所需的 P450scc、 3β HSD和 P450c17， 表明在性分化时， 雄 性胚胎能表达合成睾酮所需的酶。出生后，睾丸中 P450scc的水平由于胚胎型间质细胞的消失而降 低。从第 10天开始， 小鼠成年型间质细胞开始发育 （在从出生后第 10天开始）， P450scc的表达水
平开 始上升， 到出生后 25d达到成年小鼠的水平。在小 鼠睾丸中， P450c17在出生至 20d很低， 在 20~25d 开始增加，在 40d后到达最高（邵迎红 等， 2004）。 3β HSD有多种同工酶， 在睾丸中， 3β HSDⅠ不受 LH/hCG的调控，而 3β HSDⅥ型则受到 LH/hCG 的调控； 在培养条件下， 小鼠间质细胞中 3β HSD 呈组成型表达模式 （Payne and Sha,1991； O’ Shaughnessy ,2002）。本研究结果表明， P450scc 和 3β HSD从 30~270d之间没有明显变化， 但 P450c17的表达在 30、60和 120d没有明显差异， 在 270d的表达水平则明显下降。综合其他人的研 究结果，我们认为，在小鼠睾丸发育过程中， 3β HSD始终呈组成型表达 ； 而 P450scc和 P450c17表达水平的增加主要集中在发育早期， 随 着时间的延长， 各种酶的表达处于相对稳定的水平； 但是进入老年期后， P450c17的表达开始出现下降 趋势。邵迎红 等（2004） 的研究发现， 17β HSD表 达水平下降是引起年老大鼠血浆睾酮水平下降的主 要原因， 由于本实验没有检测17βHSD的变化， 还 不清楚在老年小鼠 17βHSD的表达水平是否会 下降。
SF1参与了 StAR蛋白、 P450scc和 P450c17的表达调节，而 SF1的活性又受到 ERK的调节 （Payne and Youngblood， 1995）。 Martinelle （2004）发现在未成年大鼠中，活化的 ERK促进了 StAR的表达，PKA和 PKC的激活是 ERK活化的 上游事件。 本实验发现睾丸中 ERK的活性在 4个时 期的变化不明显， 这可能与 ERK的活性在不同时期 的细胞对类固醇合成的影响不同有关。在未成熟的 间质细胞中， 细胞对促性腺激素的反应能力较弱， 因 此细胞内 cAMP的水平较低， 在促性腺激素的作用
下， cAMP以 PKA和 Src依赖的方式激活了 ERK， 同时通过磷酸化 SF1促进类固醇合成酶的表达， 所以活化的 ERK促进了类固醇的合成。 但是在成熟 动物的间质细胞中， 在体内促性腺激素的刺激作用， 间质细胞内 cAMP处于较高的水平， 磷酸化 SF1和 各种酶的表达水平较高； 因此， 间质细胞合成睾酮的 水平也较高，睾丸内 ERK的活性也处于相对稳定的 水平，此时 ERK的活性对类固醇合成影响不大； 在 老年动物间质细胞内， 高活性的 ERK却可以增强磷
210
第 2期 王鲜忠等：不同时期小鼠睾丸合成睾酮能力的差异
参 考 文 献
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