世界最新医学信息文摘 2019年 第19卷 第101期73
投稿邮箱：zuixinyixue@126 ·临床研究·
杨华1，吴雷2，孙赛男3，孙博谦1，王玲玲1，3
（1.北华大学附属医院 神经内科，吉林 吉林 132013；2.吉林市中心医院 心胸乳甲外科，吉林 吉林132602；
3.北华大学附属医院 精准医学中心，吉林 吉林 132013）
牦牛骨
0 引言
运动神经元病为神经系统死亡率、致残率均较高的疾病，
患者在病程中可表现为脊髓前角细胞受损、脑干运动神经元
缺失以及皮质锥体细胞和锥体束等单一损伤或累加症状。目
前尚无有效药品能阻止运动神经元病的进展，患者多在5年
内死亡，为此国内外学者将方案寄希望于神经细胞移植
以及神经细胞的自体修复，研究结果提示间充质干细胞可以 在受损的脑组织及脊髓中生存、增殖、迁移及分化成神经样
细胞。本研究旨在探讨间充质干细胞原代提取的方法及细胞
诱导分化能力，为自体细胞移植奠定基础。1 资料和方法
1.1 主要试剂。DMEM/F12培养液（Gibco ），胎牛血
清（Hyclone ），抗CD14、CD19、CD45、HLA-DR 及
CD73、CD90、CD105单克隆抗体，碱性成纤维细胞生长因子、
琼斯皇表皮生长因子购自中国碧云天生物技术公司。《骨髓、脐带
血细胞处理试剂盒》来源于加拿大威尔森公司。其他试剂均
由北华大学附属医院脑血管病研究所提供。
1.2 间充质干细胞的分离和培养。日间手术室取患者髂前上
棘5 mL 骨髓液注入15 mL 无菌离心管培养液内。按加拿大
威尔森公司研制的《骨髓、脐带血细胞处理试剂盒》说明书
进行骨髓有核细胞混悬液的制备及细胞计数。所获得的细胞 沉淀使用含10%胎牛血清的 DMEM/F12（100 u/mL 青霉
素和100 u/mL 链霉素）培养液重新制成单细胞悬液，接种
阻容分压器于培养瓶中，在5%CO 2，37℃，饱和湿度的培养箱中培养，
培养3 天后进行首次换液，弃去未贴壁细胞，后续2-3天换
液1次，待细胞融合达80%以上使用0.25%胰蛋白酶进行消
化并传代培养。
1.3 流式细胞仪鉴定骨髓间充质干细胞干性。取上述状态良
好，细胞融合度达80%者应用0.25%胰蛋白酶进行消化，细
六书通
胞离心处理后制备单细胞悬液，调整细胞浓度为1×106 个/L ，
分装于EP 管中。100 μL 单细胞悬液中分别加入抗CD14、
CD19、CD45、HLA-DR 及CD73、CD90、CD105(各20
μL)单克隆抗体反应30 min ，灭菌0.1 mol/L PBS 液进行细
胞冲洗3次，与FITC 标记的二抗避光反应30 min ，操作前0.1
挤出机螺杆设计mol/L PBS 重悬细胞。1.4 骨髓间充质干细胞成神经诱导分化。取3代内状态良好，细胞融合度达80%者应用0.25%胰蛋白酶进行消化，细胞离心处理后制备单细胞悬液，细胞按1×106个/L 接种于6孔板中，加入神经细胞诱导的DMEM/F12培养基(含2%B27、20 μg/L 碱性成纤维细胞生长因子、20 μg/L 表皮生长因子)，倒置显微镜下观察细胞的形态变化。细胞趋化似神经细胞后进行细胞爬片，玻片在室温下行4%多聚甲醛固定，经碱性磷酸酶染法，倒置显微镜下采集图像。2 结果2.1 人骨髓间充质干细胞原代提取及培养。原代提取单细胞，细胞呈现圆形或椭圆形。待细胞培养 48 h 以后可见部分细胞呈现贴壁现象，进行换液后继续培养。细胞培养至10天时细胞可呈漩涡性生长，类细胞克隆样（见图1
）。图1 骨髓间充质干细胞纯化后原代培养2.2 人骨髓间充质干细胞流式细胞术干性鉴定。流式细
胞仪检测显示，原代提取及培养人骨髓间充质干细胞表达CD73（98.6%）、CD90（99.8%）及CD105（95.2%），不表达CD14（0%）、CD19（0%）、CD45（0%）及HLA-DR （0.1%）（见图2）。2.3 骨髓间充质干细胞成神经诱导分化后碱性磷酸酶染。细胞传代至第3代的间充质干细胞成神经诱导分化细胞进行
基金项目：本文系吉林省科技厅（项目编号：20160520147JH）
作者简介： 王玲玲（1983-），博士，博士后，副主任医师，副教
谢尔宾斯基
授，研究方向：神经体统疾病的个体化。摘要：目的 对人骨髓间充质干细胞进行原代提取、细胞性质鉴定及成神经细胞分化诱导，探讨人骨髓间充质干细胞向神经细胞分化的可能性，为自体细胞移植提供种子。方法 使用试剂盒进行骨髓有核细胞混悬液的制备，纯化培养后对细胞进行流式细胞术鉴定，对成神经分化诱后细胞进行染形态学观察。结果 原代提取细胞培养至10天时可呈漩涡性生长，类细胞克隆样。细胞存在稳定的干性表达，70%骨髓间充质干细胞可实现成神经细胞诱导分化。 结论 原代人骨髓间充质干细胞可实现向成神经细胞的诱导分化。
关键词：人骨髓间充质干细胞；原代提取；神经诱导分化
中图分类号：R551.3 文献标识码：A DOI ：10.19613/jki.1671-3141.2019.101.043
本文引用格式：杨华，吴雷，孙赛男，等.人骨髓间充质干细胞原代提取及成神经诱导分化[J].世界最新医学信息文摘,2019,19(101):73-74.
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