梁柏楠
孙淑丽;樊毫军;肖培欣;丁辉;王敬;刘子泉;刘晋阳;王雪;石沙;吕琪
【摘 要】背景:间充质干细胞来源外泌体与间充质干细胞本身具有相似的功能,但外泌体释放的调控机制依然不是很清楚.目的:探讨中性鞘磷脂酶抑制剂GW4869对骨髓间充质干细胞来源外泌体释放的抑制作用及其对细胞增殖的影响.方法:将骨髓间充质干细胞分为正常对照组,GW4869处理24 h组和GW4869撤药24 h组(GW4869预处理24 h,撤药后继续培养24 h),分别收集各组条件培养基,采用超速离心法提取外泌体,Western blot法鉴定外泌体表面标志蛋白CD63、TSG101的表达,Nano-sight检测外泌体粒径分布及浓度,BCA法测定外泌体总蛋白水平,活细胞成像系统观察GW4869对骨髓间充质干细胞增殖的影响.结果与结论:①Western blot显示外泌体阳性表达标志蛋白CD63、TSG101;②纳米示综分析证实释放的外泌体大小约114 nm;③与正常对照组相比,GW4869处理24 h组和GW4869撤药24 h组外泌体释放减少差异有显著性意义(P < 0.01),而GW4869预处理24 h组和GW4869撤药24 h组差异无显著性意义(P >0.05);④与正常对照组相比,GW4869及其溶剂二甲基亚砜对骨髓间充质干细胞增殖影响差异无显著性意义(P > 0.05);⑤结果表明,GW4869可以显著抑制骨
髓间充质干细胞外泌体的释放,并且在撤药24 h内依然保持抑制作用,GW4869对骨髓间充质干细胞增殖无影响.%BACKGROUND: Bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) and BMSCs-derived exosomes have similar functions, but the regulatory mechanism underlying the release of exosomes is still unclear. OBJECTIVE: To investigate the role of GW4869, an inhibition of neutral sphingomyelinase 2, in the release of exosomes in BMSCs and the influence of GW4869 on BMSCs proliferation. METHODS: Rat BMSCs were divided into three groups: normal control group, 24-hour GW4869 treatment group and withdrawal of GW4869 for 24 hours group (24-hour GW4869 treatment followed by 24-hour successive culture with drug withdrawal). Cultured cells were collected to extract exosomes by ultracentrifugation. Western blot was used to detect exosome-associated proteins CD63 and tumor susceptibility gene 101 (TSG101). The concentration and size distribution of exosomes were measured using nanoparticle tracking analysis. BCA was used to test the level of total proteins in exosomes. Live cell imaging system was used to observe the influence of GW4869 on BMSCs proliferation. RESULTS AND CONCLUSION: (1) Western blot results showed that exosomes expressed marker protei数字通信世界
ns such as CD63, TSG101. (2) Findings from the nanoparticle tracking analysis confirmed that the size of released exosomes was about 114 nm. (3) Significantly reduced release of exosomes was found in the two treatment groups compared with the normal control group (P < 0.01), but there was no significant difference between 24-hour GW4869 treatment group and withdrawal of GW4869 for 24 hours group (P > 0.05). (4) No significant difference in the proliferation of BMSCs was found among the three groups (P > 0.05). To conclude, 24-hour W4869 can inhibit the release of exosomes by BMSCs and this inhibitory effect is still sustained within 24 hours after drug withdrawal. However, GW4869 has no influence on the proliferation of BMSCs.
【期刊名称】《中国组织工程研究》
【年(卷),期】2018(022)001
【总页数】广西劳动力市场6页(P26-31)
【关键词】外泌体;GW4869;骨髓间充质干细胞;干细胞
【作 者】孙淑丽;樊毫军;肖培欣;丁辉;王敬;刘子泉;刘晋阳;王雪;石沙;吕琪
【作者单位】武警后勤学院附属医院,救援医学研究所,天津市 300162;武警后勤学院附属医院,医教部,天津市 300162;武警后勤学院附属医院,救援医学研究所,天津市 300162;天津大学灾难医学研究院,天津市 300072;武警后勤学院附属医院,救援医学研究所,天津市 300162;天津大学灾难医学研究院,天津市 300072;武警后勤学院附属医院,救援医学研究所,天津市 300162;武警后勤学院附属医院,救援医学研究所,天津市 300162;武警后勤学院学员2旅,天津市 300309;天津大学灾难医学研究院,天津市 300072
【正文语种】中 文
【中图分类】R394.2
0 引言 Introduction
外泌体是活细胞分泌的直径30-150 nm的脂质双分子层囊泡[1]。越来越多的研究已经证明外泌体是细胞间信息传递的工具，它在正常的生理过程中担当重要角，如泌乳、炎症、细胞增殖、免疫反应等，同样与疾病的发生发展密切相关，如血栓形成、糖尿病、动脉粥
样硬化、肝脏疾病、神经退行性疾病及肿瘤[2]。间充质干细胞是具有自我复制和分化潜能的成体干细胞，很多研究已经表明间充质干细胞来源外泌体与间充质干细胞本身具有相似的功能，在修复受损组织、抑制炎性应答、调节免疫系统等方面发挥重要作用，具有广阔的应用前景，但机制依然不是很清楚[3]。另有研究表明，间充质干细胞来源外泌体在不同的肿瘤模型中可以促进或抑制肿瘤生长[4]，骨髓间充质干细胞来源的胞外囊泡能够增强慢性淋巴细胞白血病B细胞的迁移能力，帮助白血病细胞免受自发凋亡或药物诱导的细胞凋亡[5]。
外泌体形成的潜在机制包括依赖内吞体分选转运复合体(endosomal sorting complex required for transport，ESCRT)途径和不依赖ESCRT路径，后者由部分脂质驱动，例如神经酰胺、溶血磷脂酸[6]。GW4869是一种中性鞘磷脂酶2(nSMase2)抑制剂，抑制鞘磷脂分解为神经酰胺和磷脂D。已有研究表明，抑制或消除中性鞘磷脂酶2，可以抑制细胞释放外泌体[7-9]。实验旨在探讨GW4869能否抑制Wistar大鼠骨髓间充质干细胞外泌体的释放及撤药24 h后的抑制效果，以期为探讨骨髓间充质干细胞来源外泌体在疾病中的作用提供理论基础，并为肿瘤、白血病等提供新的临床思路。
1 材料和方法 Materials and methods
金花清感方1.1 设计 细胞学体外实验。
1.2 时间及地点 于2016年11月至2017年5月在武警后勤学院附属医院救援医学研究所完成。
1.3 材料 Wistar大鼠骨髓间充质干细胞(赛业生物技术有限公司)；干细胞基础培养基、干细胞专用胎牛血清、双抗、L-谷氨酰胺、0.25%Trypsin-0.04%EDTA (赛业生物技术有限公司)；GW4869(Sigma公司)；BCA蛋白浓度测定试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)；兔源CD63、TSG101多克隆抗体、HRP标记山羊抗兔IgG二抗(Proteintech公司)；二甲基亚砜(北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司)；JULI-stage 活细胞成像系统(韩国NanoEntek公司)；超速离心机(美国Beckman公司)；Nano-sight NS300仪器(德国Malvern公司)。中国同学录5460
1.4 实验方法
superboost1.4.1 骨髓间充质干细胞培养及分组 将骨髓间充质干细胞随机分为正常对照组，GW4869处理24 h组和GW4869撤药24 h组(GW4869预处理24 h，撤药后继续培养24 h)。Wistar大鼠骨髓间充质干细胞培养于完全培养基中(基础培养基加入体积分数为10%胎牛血清、100
U/mL青霉素溶液、0.1 g/L链霉素溶液、2 mmol/L L-谷氨酰胺)，在37 ℃、体积分数为5% CO2及饱和湿度的培养箱中进行细胞培养。待细胞融合至80%左右时，弃完全培养基，PBS洗涤2遍，0.25%Trypsin-0.04%EDTA消化细胞，按照1×106个活细胞/T75培养瓶的密度接种细胞，接种24 h待细胞贴壁后，GW4869撤药24 h组PBS洗涤3遍，更换为终浓度为10 μmol/L GW4869(0.29%二甲基亚砜溶剂)的完全培养基继续培养，正常对照组和GW4869处理24 h组PBS洗涤3遍后继续用完全培养基培养。24 h后各组细胞均用PBS洗涤3遍，正常对照组和GW4869撤药24 h组更换为不含胎牛血清的条件培养基(不含胎牛血清，其余成分相同)，GW4869处理组更换为终浓度为10 μmol/L GW4869(0.29%二甲基亚砜溶剂)的不含胎牛血清的条件培养基，继续培养24 h后收集各组条件培养基。
图1 骨髓间充质干细胞及其来源外泌体CD63、TSG101的表达Figure 1 The expression of CD63 and TSG101 in bone marrow mesenchymal stem cells and cell-derived exosomes
图2 纳米颗粒示综分析外泌体浓度及粒径分布(1︰100稀释)Figure 2 Nanoparticle tracking analysis of concentration and particle size distribution of exosomes (at 1:100 dilution )
图3 BCA法检测各组外泌体蛋白量Figure 3 The total amount of exosome proteins detecte
d by BCA method图注：与正常对照组相比，aP < 0.01。
图4 GW4869(10 μmol/L)对骨髓间充质干细胞增殖的影响Figure 4 GW4869 (10 μmol/L) exhibits no influence on proliferation of bone marrow mesenchymal stem cells
1.4.2 外泌体提取 收集各组条件培养基，采用超速离心方法提取外泌体[10]。具体步骤简述如下：将收集到的条件培养基置于50 mL离心管中，4 ℃，500×g离心10 min，去除死细胞沉淀；收集离心后所得上清置于另一50 mL离心管中，4 ℃，2 000×g离心20 min进一步去除细胞碎片及大分子蛋白；再次收集上清于50 mL离心管中，4 ℃，10 000×g离心30 min，收集上清并通过0.22 μm细胞滤器，去除直径大于0.22 μm的物质；收集上清于超速离心管中，4 ℃，120 000×g条件下超速离心70 min，弃上清；PBS重悬沉淀后再次4 ℃，120 000×g离心70 min，弃上清，得到外泌体沉淀，50 μL PBS重悬外泌体。-80 ℃保存备用。
1.4.3 Western blot检测外泌体标志蛋白CD63、TSG101的表达 取正常对照组骨髓间充质干细胞条件培养基分离纯化的外泌体15 μL，加入5 μL 4×蛋白上样缓冲液，保持95 ℃变性5 min。用含1%PMSF的RIPA裂解5×106个骨髓间充质干细胞，提取细胞蛋白作为阳性对
照。SDS-聚丙烯酰胺凝胶(10%)电泳，将SDS-聚丙烯酰胺凝胶及PVDF膜置于半干转膜仪中转膜50 min，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，一抗(兔源CD63、TSG101多克隆抗体1︰1 000稀释) 4 ℃孵育过夜。TBST洗膜，辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG二抗(1︰1 000稀释)室温孵育1 h，TBST洗膜，曝光、显影。
1.4.4 Nano-sight检测外泌体浓度及粒径分布 使用Nanosight-NS300仪器对正常对照组骨髓间充质干细胞条件培养基提取的外泌体行纳米颗粒示综分析(nanoparticle tracking analysis，NTA)，检测外泌体浓度及粒径分布。无菌PBS将外泌体样本稀释100倍，用注射泵加载到Nanosight-NS300仪器中，识别和跟踪做布朗运动的每个粒子中心，用NTA 3.2软件采集并分析数据。
1.4.5 总蛋白含量测定 使用BCA蛋白质定量试剂盒测量各处理组条件培养基提取的外泌体总蛋白量。BSA为蛋白标准品，依据试剂盒说明书进行操作。
1.4.6 活细胞成像系统检测细胞增殖 骨髓间充质干细胞按照2×105个/孔的密度接种于6孔板中，分别加入完全培养基，含0.29%二甲基亚砜的完全培养基，终浓度为10 μmol/L GW4869(0.29%二甲基亚砜溶剂)的完全培养基。将6孔板置于活细胞成像系统，调节曝光
强度和曝光时间，直至出现清晰图像，设置程序为58 cycle×2 h。采用STAT软件分析图像数据，根据细胞生长密度作出细胞生长曲线。
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