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干货 | PROTAC知多少
PROTAC是源于诺贝尔化学奖的一项热门技术。应广大客户的强烈要求，小编今天也请我们的M博士来为大家讲讲PROTAC的那些事~
PROTAC本质化学成分
PROTAC是一种杂合双功能小分子化合物，结构中含有两种不同配体，一个是泛素连接酶E3配体，另一个是与细胞中目标靶蛋白结合的配体，两个配体之间通过Linker相连，从而形成“三体”聚合物——靶蛋白配体-Linker-E3配体。然后通过E3连接酶给靶蛋白加上泛素化标签，启动细胞内强大的泛素化水解过程，通过泛素-蛋白酶体途径特异性地降解靶蛋白。 PROTAC原理
PROTAC分子在进入细胞后，其结构中的目标蛋白（Protein of interest, POI）配体可特异性地与相应的靶蛋白结合，而另一端可以募集E3连接酶从而形成POI-Linker-E3 ligase三元复合物，其中E3连接酶可介导泛素结合酶E2对POI泛素化。被泛素标记的POI被蛋白酶体识别并降解。此过程无需靶蛋白配体长时间占据结合位点，只需三元复合物短暂的形成便可瞬时完成目标蛋白的泛素化，并且PROTAC在细胞内可多次循环利用。
泛素-蛋白酶体途径
细胞中的很多信号通路是通过泛素-蛋白酶体途径选择性降解某些关键调控蛋白来实现调控的。细胞内每时每刻都有数以千计的蛋白泛素化过程在进行，这种对特定蛋白高度特异的识别机制主要是由E3泛素连接酶决定的。
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1978年12月发生了什么大事
泛素分子(Ubiquitin)：是一种由 76个氨基酸组成的小蛋白。具有高度保守的序列且存在于所有已知的
时尚前沿真核生物体中。主要功能是标记需要分解掉的蛋白质，使其被蛋白酶体降解。泛素链与蛋白底物的结合形成被蛋白酶体降解的识别信号。单独的泛素本身并没有任何生物功能，只是一种分子标记蛋白，发挥作用必须在 ATP 提供能量的前提下依靠泛素途径的相关酶类及蛋白酶体。
蛋白酶体 (Proteasome)：26S 蛋白酶体是 ATP 依赖型蛋白水解复合体，由 2个 19S 调节 亚单位，1个 20S 核心亚单位， 和 11S 调节因子构成；组成一种桶状结构，2个 19S 亚单位 位于桶状结构的两端，识别多聚泛素化蛋白并使其去折叠。20S 为催化亚单位，位于两个 19S 亚单位的中间，其活性部位处于桶状结构的内表面，可避免细胞环境的影响。20S 有胰蛋白
酶、糜蛋白酶和谷氨酰样肽水解活性，可以裂解大多数的肽键。
• Inhibitors • Agonists • Screening Libraries 泛素-蛋白酶体途径（ubiquitin-proteasome pathway, UPP ）：是细胞内蛋白降解的主要途径，参与细胞内 80%以上蛋白质的降解。泛素分子在一系列酶作用下，将细胞内的蛋白质分类，从中选出靶蛋白分子，对靶蛋白进行特异性修饰的过程，形成靶蛋白多聚泛素链。这些酶包括泛素激活酶（E1），泛素结合酶（E2）、泛素连结酶（E3）等。这一过程是一个三酶级联反应。靶蛋白被泛素（多肽）标记，然后被蛋白酶体识别和降解。通过这样一个需要消耗能量的过程，细胞以高度特异方式对不需要的蛋白进行降解。值得一提的是，泛素化过程也是可逆的，泛素可被去泛素化酶（Deubiquitinase, DUB ）从泛素链上去除，形成反向调节。
泛素化在蛋白质的代谢、调节和降解中起重要作用，蛋白质泛素化是生物体内一种常见的翻译后修饰，同时参与细胞周期、凋亡、分化等几乎一切生命活动的调控。泛素化与肿瘤、心血管、自身免疫等疾病的发病密切相关。
dBET1由 BRD4抑制剂 JQ1（ HY-13030）与 Thalidomide 衍生物通过 Linker 产生的
PROTAC 。能够在低纳摩尔浓度下诱导 BRD4降解 dBET1显着降低了 BRD2、BRD3和 BRD4水平，同时具有较小的脱靶降解效应。
BI-3663由 PTK2/FAK 抑制剂 BI-4464与 Pomalidomide 衍生物通过 Linker 产生
的PROTAC 。能够在低纳摩尔浓度下诱导 PTK2降解。
多样化的 E3连接酶
目前已经发现有 600多种 E3泛素连接酶复合体，下面介绍研究最热的 2种：von Hippel-Lindau (VHL)型和 Cereblon (CRBN)型。
Cullin 蛋白
Cullin (Cul)家族可形成调节细胞周期的活性复合体。Cullin (Cul)家族有 6个成员蛋白Cul1，Cul2，Cul3, Cul4, Cul5, Cul7
。
PROTAC 相关产品
ARV-771是一种通过PROTAC 技术形成的有效BET 降解剂。对BRD2(1)，BRD2(2)，BRD3(1)，BRD3(2)，BRD4(1)和BRD4(2)的Kd 值分别为
34，4.7，8.3，7.6，9.6和 7.6nM 。ARV-771一端是泛素连接酶E3配体，另一端是与靶蛋白BET 结合配体，两个配体之间通过linker 相连，从而使ARV-771特异性低降解BET
蛋白。
N端有Cul重复结构 (Cul repeat, CR)
C端有Cul同源区 (Cul homology, CH) , Neddy8修饰位点：转录后修饰。
第一种：Von Hippel-Lindau (VHL)型E3泛素连接酶复合体
VHL基因是一种抑癌基因，其蛋白产物VHL可与ElonginB、ElonginC、Cullin2蛋白组成VBC (VHL-ElonginB/C-CUL2)复合物，该复合物属于E3-泛素蛋白酶系统，介导人体内多种蛋白的降解。癌症中VHL经常发生突变，近 70% 的突变都是破环了VHL与Elongin的结合。
第二种：Cereblon (CRBN)型E3泛素连接酶复合体
羟脑苷脂 (Cereblon, CRBN) 是一种具有离子蛋白酶活性的大脑相关蛋白，可与DNA损伤结合蛋白-1 (DDB1)、滞蛋白 4 (Cullin4, Cul4A或Cul4B) 和调节因子Cullins 1 (RoC1)相互作用形成功能牲E3泛素连接酶复合体 (CRBN-CRL4)，结合底物后通过泛素-蛋白酶体途径进行蛋白水解。Cereblon也是免疫调节剂 (IMiD) 抗骨髓瘤作用的必需靶蛋白。Lenalidomide，和Pomalidomide等与CRBN结合时会招募新的底物，使其结合在CRBN-CRL4上，导致其泛素化和蛋白酶体依赖的降解增加。CRBN-CRL4复合体对四肢的发育有重要作用。
Cullin蛋白家族的其他成员也可形成不同的E3泛素连接酶复合体，如下图：
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