+olig分组处理18小时，应用流式细胞术检测细胞凋亡情况，结果显示寡霉素能够耗竭细胞内ATP而导致细胞大量凋亡，与对照组比较具有统计学差异，P<0.05；同时给予2mM腺苷能够明显逆转寡霉素导致的细胞死亡，与寡霉素组比较具有统计学差异，P<0.05。 1.6 双嘧达莫（DP）拮抗腺苷的细胞保护和细胞毒性作用 t66手机1.6.1拮抗增殖抑制作用
K562细胞培养于含有2g/L右旋葡萄糖、血清浓度10%的培养基中，按对照、Ade (2mM)、DP (5µM) 和Ade +DP分组处理24小时，应用细胞计数仪进行细胞计数，结果显示腺苷能够抑制k562细胞的增殖，差异具有统计学意义，P<0.05；双嘧达莫能够部分拮抗腺苷的这一作用，与Ade组比较具有统计学差异，P<0.05。
1.6.2拮抗细胞保护作用
K562细胞培养于无糖培养基中，按对照、Ade (2mM)、DP (5µM)、olig (0.5µg/ml)、Ade +olig组和olig +Ade +DP组处理18小时，应用流式细胞术检测细胞凋亡情况，结果显示寡霉素导致大量k562细胞死亡，同时给予腺苷能够提高细胞的存活率，差异具有统计学意义，P<0.05；双嘧达莫能够拮抗腺苷的细胞保护作用，与olig +Ade组比较差异具有统计学意义，P<0.05。
1.6.3拮抗增加ATP的作用
somK562细胞培养于无糖培养基中，按对照、Ade (2mM)、DP (5µM)、olig (0.5µg/ml)、Ade +olig组和olig +Ade +DP组处理3小时，应用荧光素酶发光法检测细胞内ATP水平，结果显示寡霉素使细胞内ATP含量减少，同时给予腺苷处理可将细胞内ATP水平恢复，而双嘧达莫几乎能够完全逆转腺苷所增加的ATP，使细胞内ATP回到与olig组同一水平。
2. 腺苷对蛋白酶体抑制剂诱导细胞死亡的敏感性的影响
2.1 腺苷提高蛋白酶体抑制剂（PI）诱导细胞死亡的敏感性
2.1.1 提高细胞死亡敏感性-流式细胞术
K562细胞培养于含有2g/L右旋葡萄糖的培养基中，按对照、MG132 (5µM)、Ade (0.1、0.5、2mM)、MG132 (0h) +Ade (0.1、0.5、2mM)、MG132 (6h) +Ade (0.1、0.5、2mM)分组处理15h，应用AnnexinV-FITC-PI流式细胞术检测细胞凋亡情况，得如下结果：（1）低浓度的腺苷（0.1mM、0.5mM）可以剂量依赖性增加MG132
诱导的k562细胞死亡。腺苷与MG132同时处理时可分别使细胞死亡率增加3.55%和8.35%，后者差异具有统计学意义，P<0.05；在MG132作用6小时之后给予腺苷处理分别使细胞死亡增加了11.45%、18.
1%，差异具有统计学意义，P<0.05；同一浓度的腺苷，在6小时后给予所产生的增敏程度高于同时给予所产生的增敏程度，前者导致的细胞死亡率分别比后者增加了7.9%和9.75%。（2）在MG132作用6小时之后给予高浓度的腺苷（2mM）处理，能够增加MG132诱导产生的细胞死亡，细胞死亡率增加了23.2%，差异具有统计学意义，P<0.05；2mM腺苷与MG132同时处理时逆转MG132的细胞毒作用，使细胞死亡率降低了14.55%。
2.1.2 提高死亡敏感性-细胞形态学
K562细胞培养于含有2g/L右旋葡萄糖的培养基中，按对照、MG132 (5µM)、MG132 (0h) +Ade (0.1、0.5、2mM)、MG132 (6h) +Ade(0.1、0.5、2mM)分组处理后加入碘化吡啶(PI)染液，应用荧光倒置显微镜进行细胞形态学动态监测，共记录24小时。以15小时照片为例，得到如下结果：（1）低浓度的腺苷（0.1mM、0.5mM）可以增加MG132诱导的k562细胞死亡。腺苷与MG132同时处理时在形态学上表现为细胞死亡的轻微增加；MG132作用6小时之后给予腺苷处理则表现为形态学上细胞死亡明显加重，PI荧光增多增强。（2）在MG132作用6小时之后给予2mM腺苷处理，推动细胞形态在MG132组的基础上更进一步向死亡方向改变，明显提高了MG132诱导细胞死亡的敏感性；2mM腺苷与MG132同时处理时逆转MG132诱导细胞产生的形态学上死亡改变，形态学照片与对照组相似；（3）MG132作用6小时之后给予腺苷处理，腺苷剂量依赖性加重MG132诱导产生的细胞死亡。
以上结果显示当细胞内ATP水平处于生理浓度下，相对低浓度腺苷处理能够提高蛋白酶体抑制剂诱导细胞死亡的敏感性。
2.2 低能量状态下腺苷提高蛋白酶体抑制剂（PI）诱导细胞死亡的敏感性
2.2.1 腺苷死亡敏感性-流式细胞术
水凝萃
K562细胞培养于无糖培养基中，处于低能量状态，按对照、MG132 (5µM)、Ade (0.1、0.5、2mM)、MG132 (0h) +Ade (0.1、0.5、2mM)分组，处理12小时后，应用AnnexinV-FITC-PI流式细胞术检测细胞凋亡情况，得出如下结果：腺苷能
够剂量依赖性增加MG132诱导产生的k562细胞死亡，各组间差异具有统计学意义，P<0.05。寿镜吾
2.2.2 提高死亡敏感性-细胞形态学
K562细胞培养于无糖培养基中，处于低能量状态，按对照、MG132 (5µM)、Ade (0.1、0.5、2mM)、MG132 (0h) +Ade(0.1、0.5、2mM)分组处理后加入碘化吡啶（PI）染液，应用荧光倒置显微镜进行细胞形态学动态监测，共记录24小时。以第12小时相差通道照片和第24小时TRITC通道PI阳性细胞照片为例，得到如下结果：腺苷能够剂量依赖性地加重MG132诱导产生的形态学上细胞死亡，使PI荧光增多增强。
上述结果表明，细胞内ATP水平低于生理浓度时，腺苷能够提高蛋白酶体抑制剂（PI）诱导细胞死亡的敏感性。
2.3 下调细胞内ATP拮抗腺苷对蛋白酶体抑制剂（PI）的增敏作用
2.3.1 寡霉素（oligomycin）拮抗增敏
2.3.1.1 Oligomycin拮抗增敏作用-流式细胞术
K562细胞培养于无糖培养基中，按对照、MG132 (5µM)、Ade (2mM)、oligo (0.5µg/ml)、MG132 (0h) +Ade 、MG132+oligo (0h) +Ade分组处理18小时，应用AnnexinV-FITC-PI流式细胞术检测，得到如下结果：腺苷能够明显加重MG132诱导的细胞死亡，而 oligomycin能够完全逆转腺苷的这种增敏作用。
K562细胞培养于无糖培养基中，按对照、MG262 (1µM)、Ade (2mM)、oligo (0.5µg/ml)、MG262 (0h) +Ade、MG262 +oligo (0h) +Ade2mM分组处理18小时，应用AnnexinV-FITC-PI流式细胞术检测，得到如下结果：腺苷与MG262同时处理时能提升MG262组的细胞死亡率，而利用oligomycin下调细胞内ATP后可使细胞死亡率部分恢复，腺苷对MG262的增敏作用被部分拮抗。
2.3.1.2 Oligomycin拮抗增敏作用-细胞形态学
K562细胞培养于无糖培养基中，按对照、MG132 (5µM)、MG262 (1µM)、Ade (2mM)、oligo (0.5µg/ml)、MG132 (0h) +Ade、MG262 (0h) +Ade、MG132 +oligo (0h) +Ade、MG262 +oligo (0h) +Ade处理后加入碘化吡啶（PI）染液，应用荧光倒置显微镜进行细胞形态学动态监测，共记录24小时。以第24小时的照片为例，得到如下结果：腺苷与MG132/MG262同时处理时均能导致形态学上细胞死亡
明显加重，PI荧光增多增强，同时给予oligomycin下调细胞内ATP后，这种细胞死亡加重的现象可以被部分逆转，腺苷增多PI阳性细胞的作用被部分拮抗。
2.3.2 2-脱氧葡萄糖（2-DG）拮抗增敏作用
K562细胞培养于无糖培养基中，按对照、MG132 (5µM)、Ade (2mM)、2-DG (5mM)、MG132 (0h) +Ade、MG132 +2-DG (0h) +Ade处理后加入碘化吡啶（PI）染液，应用荧光倒置显微镜进行细胞形态学动态监测，共记录24小时。以第12小时的照片为例，得到如下结果：MG132 +2-DG (0h) +Ade组的PI阳性细胞数目明显少于MG132 +2-DG (0h) +Ade组。
2.3.3 双嘧达莫（DP）拮抗增敏作用
K562细胞培养于无糖培养基中，按对照、MG132 (5µM)、Ade (2mM)、DP (5µM)、MG132 (0h) +Ad
e、MG132 +DP5µM (0h) +Ade分组处理后加入碘化吡啶（PI）染液，应用荧光倒置显微镜进行细胞形态学动态监测，共记录24小时。以第15小时相差通道照片和第24小时TRITC通道PI阳性细胞照片照片为例，得到如下结果：腺苷与MG132同时处理时能导致形态学细胞死亡明显加重，PI 荧光增多增强，同时给予DP处理时能逆转腺苷加重细胞死亡的作用，细胞形态和PI阳性照片与MG132组接近。
前期实验结果已经证实寡霉素和2-脱氧葡萄糖分别可以下调培养于无糖培养基和右旋葡萄糖培养基中的细胞内的ATP水平，本实验也证实了双嘧达莫可以下调腺苷所增加的细胞内ATP，故各种下调细胞内ATP水平的手段均能够拮抗腺苷对蛋白酶体抑制剂的增敏作用的结果说明，腺苷对蛋白酶体抑制剂的增敏作用是在细胞内被代谢为ATP后产生的。
2.4 Caspase途径介导了腺苷调控蛋白酶体敏感性
2.4.1 广谱Caspase抑制剂抑制增敏作用
K562细胞培养于含有2g/L右旋葡萄糖的培养基中，按对照、MG132 (5µM)、MG132 (6h) +Ade、Z-VAD (100µM)、MG132 +Z-VAD (6h) +Ade分组处理后加入碘化吡啶（PI）染液，应用荧光倒置显微镜进行细胞形态学动态监测，共记录24小时。以第15小时相差通道和TRITC通道PI阳性细胞照片为例，得到如下结果：Z-VAD100µM可以逆转MG132和腺苷共同作用时导致的大量细胞死亡。形态学上判断caspase抑制剂可以阻断MG132和腺苷联合产生的作用。
2.4.2 增敏作用与Caspase系统活化相关
蔡星辰
K562细胞培养于含有2g/L右旋葡萄糖的培养基中，按对照、MG132 (5µM)、Ade (0.2、1.0、2.0mM)、MG132 (0h) +Ade(0.2、1.0、2.0mM)分组处理12小时，应用western blotting法检测细胞凋亡通路上caspase家族相关蛋白（caspase8、9、3）和下游PARP蛋白以反映细胞凋亡情况，得到如下结果：（1）0.2mM和1.0mM 的腺苷均能够剂量依赖性增多MG132引起的蛋白降解。（2）2mM腺苷使MG132引起的蛋白降解减少，产生与低浓度腺苷相反的作用。
2.4.3 不同能量状态下caspase系统及PARP改变的比较
K562细胞分别培养于右旋葡萄糖培养基和无糖培养基中，分别按对照、PI、Ade (2mM)、PI (0h) +Ade、PI (6h) +Ade分组处理12小时，应用western blotting 法检测细胞凋亡通路上Caspase家族相关蛋白（caspase8、9、3）和下游PARP 蛋白的变化，得到如下结果：（1）右旋培养基培养细胞，胞内ATP处于生理浓度下，相对高浓度腺苷（2mM）与PI之间作用时间关系决定着caspase家族相关蛋白和PARP蛋白的变化：同时给予2mM腺苷和PI处理，前者能明显逆转后者导致的caspase家族相关蛋白和PARP蛋白的降解；给予PI6个小时之后才给予2mM腺苷，腺苷反而能够明显增加PI所导致的上述蛋白的降解。（2）无糖培养基培养细胞，胞内ATP低于生理浓度，2mM腺苷能够明显增加PI引起的caspase家族相关蛋白和PARP蛋白的变化，PI (6h) +Ade组出现的蛋白降解比PI (0h) +Ade更加严重。
结论
1. 腺苷具有细胞保护和细胞毒性双向性作用，细胞内ATP浓度决定了腺苷的
双向调节作用
2. 腺苷增加蛋白酶体抑制剂诱导细胞死亡的敏感性，腺苷增敏作用与Caspase 系统活化有关
关键词：腺苷；ATP；敏感性；蛋白酶体抑制；细胞保护；细胞毒性
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