生物技术进展 2023 年 第 13 卷 第 2 期 210 ~ 219 Current Biotechnology ISSN 2095‑2341
进展评述
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邱思元 ， 徐晶雪 * ， 段育阳 ， 赵金玉 ， 赵文婧 ， 张莉欣 ， 任国领
大庆师范学院生物工程学院，黑龙江 大庆 163712
摘 要：甘露糖赤藓糖醇脂（mannosylerythritol lipids, MELs ）是一种生物表面活性剂，除具有可降解、毒性低、生物兼容性好等优点，还因其特有的代谢、合成途径与结构特性，而具有基因转染、广谱抗菌、皮肤修复等多种功能。MELs 在医疗、日化、食品、农业、生态修复等各领域应用前景巨大，被公认为是现今最有潜力的生物表面活性剂。然而，不同种属所生产的MELs 之间结构差异性大且生产方式较落后，合成与作用机制尚不清晰，因而无法实现规模商业化生产。从结构特性、生产纯化、应用途径等方面重点阐述了MELs 相关研究进展，以期阐明其结构与功能的多样性，为实现靶向MELs 的定制生 产，降低生产成本，加快实现其规模化应用提供参考。关键词：甘露糖赤藓糖醇脂；生物表面活性剂；微生物DOI ：10.19586/j.2095‑2341.2022.0131
中图分类号：Q549, TQ423 文献标志码：A
Research Progress on Production and Application of Mannosylerythritol Lipids
QIU Siyuan ， XU Jingxue * ， DUAN Yuyang ， ZHAO Jinyu ， ZHAO Wenjing ， ZHANG Lixin ，
REN Guoling
College of Bioengineering ， Daqing Normal University ， Heilongjiang Daqing 163712， China
Abstract ：As a type of biosurfactant ， mannosylerythritol lipids （MELs ） have merits with biodegradability ， low toxicity and good biocompatibility. Due to its distinct structural ， metabolic ， and synthetic features ， it also performs a wide range of other tasks ， including skin restoration ， gene transfection ， and broad -spectrum antibacterial activity. MELs has a promising future in a number
of industries ， including medicine ， daily chemicals ， food ， agriculture ， and ecological restoration ， which is widely recognized as one of the most promising biosurfactants. However ， because of the great structural heterogeneity ， backward manufacturing style
of MELs generated by various species ， hazy synthesis and uncertain mechanism of action ， it is hard to carry out large -scale commercial production. The paper aimed to clarify the diversity of its structure and function ， so as to provide reference for the realization of customized production targeting MELs. By focusing on the aspects of structural characteristics ， production purification ，
application path and so on ， the paper was hoped to help reduce the production cost and accelerate the realization of its large -scale application.
Key words ：mannosylerythritol lipids ； bio -surfactants ； microorganism
生物表面活性剂是一种两亲性产物，相对于化学表面活性剂更易降解，对环境更友好。生物表面活性剂在工业、农业、餐饮、日化等行业应用广泛，故寻高效、高产、低成本的生物表面活性剂尤为关键。甘露糖赤藓糖醇脂（mannosylerythri
tol lipids ， MELs ）是一种由不同真菌分泌产生的新型糖脂类非离子型生物表面活性剂。根据不同种属所产的MELs 乙酰化程度不同，可分为4种同系
物：MEL -A 、MEL -B 、MEL -C 和MEL -D 。MELs 具有多种生化功能，在诱导细胞分化、抗肿瘤［1］、广谱抗收稿日期：20220712； 接受日期：20221117基金项目：黑龙江省联合引导基金项目（LH2020C070）； 2022年黑龙江省大学生创新创业训练计划项目（S202210235030)。：邱思元 E -mail ：*****************； *通信作者 徐晶雪 E -mail ：****************
邱思元，等：甘露糖赤藓糖醇脂生产及应用研究进展
菌活性［2］、修复受损皮肤［3-4］、食品添加剂［5］等方面具有极高应用价值，如MELs 拥有类似神经酰胺的功能，可以维持皮肤水分；作为食品添加剂，可提高食品保质期并保持较好的口感。
截至目前，除了用特定的菌株生产MELs 外，生产上已经可以通过基因工程、同源重组等手段合成所需的MELs 。随着靶向MELs 的定制生产，多样结构的MELs 可发挥多种用途，其应用的发掘对于生物表面活性剂的研究具有重要意义。本文从MELs 的结构与特性，合成、纯化与定性，生产3个方面阐述了MELs 的相关研究进展，并总结了MELs 的应用领域，展望了今后的发展方向，以期为MELs 的研究、生产以及实际应用提供参考。
1 MELs 的结构与特性
1.1 MELs 的结构
MELs 由两部分组成，亲水部分为甘露糖赤藓
糖醇，疏水部分为脂肪酸链和乙酰基（图1）。其
中甘露糖赤藓糖醇C4和C6位置的乙酰化程度不同，自组装性、疏水性等各种生化特性也不相同。根据MELs 不同的乙酰化程度可分为MEL -A 、MEL -B 、MEL -C 、MEL -D 4种同系物。MEL -A 在C4、C6上分别连接一个乙酰基，是二乙酰化合物；MEL -B 在C6位置乙酰化、MEL -C 在C4位置乙酰化，分别只有一个乙酰基，为单乙酰化合物；MEL -
D 为完全脱乙酰化合物［1］。
1.2 MELs 的特性
1.2.1 MELs 的自组装性 自组装（self -assembly ，SA ）是一种在无外力或刺激的情况下，分子单元可通过非共价相互作用自发或可逆地组织成有序结构。MELs 的不同乙酰化程度表现出不同的自组装特性，包括脂质体、自组装单层、薄片相、海绵
相和双连续立方相。Tomotake 等［2］通过水渗透技术观察到MELs 的分子结构，首次提出MELs 具有自组装能力的推测。随后，Azusa 等［3］利用同源重组技术敲除PtMAT1基因，通过质粒转化、薄层谱等方法证明PtMAT1基因对MEL -D 产生具有关键作用，同时也证实MELs 确实具有自组装特性。Takanori 等［4］研究了不同结构的MEL -A 、MEL -D 对自组装性的影响，结果显示MEL -B 8、MEL -C 13
和MEL -D 18形成大侧面，而MEL -A 3没有形成大侧面，这表明在4′-OH 和/或6′-OH 的存在下，微小的差异就能导致自组装结构形态的剧烈变化。1.2.2 MELs 的界面特性 天然产生的MELs 表面张力在28~33 mN ·m -1，自定义组装的MEL -D 表面张力会略有下降，但乳化效率有所提高。范琳琳等［5］测定了MEL -A 的临界胶束浓度（critical micelle concentration ， CMC ），当MEL -A 浓度为14.2 mg ·L -1时其表面张力最低为27.69 mN ·m -1，虽然相比于SE10、Span20等化学合成糖脂的CMC 较小，但对于石油醚和大豆油的乳化率可以达到60％以上。随后，Fabienne 等［6］通过测量
木兰基醇染的液滴直径，来确定自组装合成MEL -D 的表面张力，并将MEL -D 与玉米油、辛酸混合检测其乳化能力，结果显示合成的MEL -D 表面张力下降，证明含有侧链的MELs 乳化效率更高。以上实验均表明自组装的MELs 界面特性良好，尤其乳化性能增加，因此具有大规模开发并应用于实践的潜力。此外，Tokuma 等［7］对比了不同乙酰化程度的MELs （MEL -B 和MEL -D ）的界面特性，发现随着乙酰化程度的降低，MEL -D 的CMC 值和亲水性均大于MEL -B ，表明MELs 的界面特性与其乙酰化程度有关。
2 MELs 的合成、纯化与定性
2.1 MELs 的生物合成
2.1.1 MELs 的生物代谢合成 通常情况下，MELs 的合成分为4步：①植物油被脂肪酶催化水解形成甘油和脂肪酸，并通过β-氧化途径对脂肪
酸进行修剪；②脂肪酸被引入细胞，甘油部分水解，供应的糖转化为MELs 前体——赤藓糖醇和鸟苷二磷酸（guanosine diphosphate ， GDP ）-甘露糖；③PtEMT1p 编码的糖基转移酶从内消旋使GDP -甘露糖转移到赤藓糖醇中，
产生甘露糖基赤藓糖注：MEL-A ：R 1=R 2=Ac ；MEL-B ：R 1=Ac ，R 2=H ；MEL-C ：R 1=H ，R 2=Ac 。n =6~10
图1 MELs 的化学式Fig. 1 Chemical formula of MELs
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醇（ME ）。在β-氧化途径中，酰基辅酶A 在PtMAC1p 和PtMAC2p 编码下与ME 中甘露糖2′-和3′-位的羟基结合，合成脱乙酰化的MEL （MEL -D ）；
④乙酰辅酶A 通过PtMAT1p 编码的乙酰转移酶从C -4′转移到C -6′位置，最终形成乙酰化的MEL （MEL -A 、MEL -B 和MEL -C ）。
2.1.2 MELs 相关基因与酶的调控合成 MELs 以正构烷烃为底物的生物合成途径有3种：①从头合成和β-氧化途径；②链延伸途径；③整合掺入途径。当底物添加链长为C n 的脂肪醇或脂肪酸时，β-氧化途径起关键性作用。β-氧化将MELs 合成进入“缩链途径”使长链缩短，以便进入乙酰辅酶A 循环，产生发酵产物为C n −2、C n −4、C n −6等不同链
长的脂肪链。目前“缩链途径”相关机制尚不完全清楚，但该机制的提出为细胞外糖脂的生物合成提供了重要思路。
糖基转移酶Emt1、乙酰基转移酶Mat1和两个酰基转移酶Mac1和Mac2是MELs 合成至关重要的基因簇。其中糖基转移酶Emt1可以催化赤藓糖醇和甘露糖的缩合；酰基转移酶能够利用不同长度的酰基修饰碳水化合物骨架；Mac1将短侧链连接到C2位置，Mac2催化长侧链转移到C3位置的碳水化合物部分。4种基因簇的不同导致甘露糖C4和C6位置的乙酰化程度不同，从而产生
MEL -A 、MEL -B 、MEL -C 和MEL -D 4个不同特性的这样紫啊
变体［8］
（图2）。
2.2 MELs 的纯化
2.2.1 MELs 传统柱谱纯化法 柱谱的原理为利用混合物组分在固定相和流动相之间分配不同造成的流动差异而实现对产物分离分析，其中硅胶层析能从发酵液中较好地纯化出MELs ［10］。柱谱法的分离工艺简便、分离效果好、回收率高，洗脱液也可蒸馏回收，制备量也较大，几乎绝大部分实验都采用该传统纯化方法，可根据产物和目的不同采用不同的洗脱剂。比如：段正巧等［11］连续加入二氯甲烷∶冰醋酸＝200∶3作为洗脱剂洗脱；Tomotake 等［12］将含有糖脂的乙酸乙酯提取物分离并蒸发，浓缩的糖脂溶解在氯仿中，用硅胶柱分析纯化，使用氯仿∶丙酮（10∶0~0∶10，体积比）混合物作为溶剂体系洗脱。这两种洗脱方式均可较好地纯化MELs ，但定性能力差的缺点也尤为突出。
2.2.2 MELs 的新型纯化方法 Cristiano 等［13］开
发了一种超滤工艺以纯化MELs 。通过台式秤超滤，将初始进料量从250 mL 减少到25 mL ，最终获得860 mg ·L -1的高浓度MELs 溶液。利用MELs 的自组装特性使其能够通过膜过滤实现一步到位纯化，最终产生高度浓缩的MELs 。该实验过程简单方便，但是成本相对较高，不适于规模化生产。
2019年Liang 等［14］通过薄层谱（thin layer
chromatography ， TLC ）分析、液质联用（liquid chromatography -mass spectrometry ， LC -MS ）鉴定创造了一个新的提取系统：先用甲醇∶水∶正己烷（体积比=2∶1∶1）进行提取，再用甲醇∶
水∶正己烷（体积比=3∶1∶1）进一步萃取回收，最后用甲醇∶正己烷（体积比=1∶1）进行纯化。此体系可以有效地去除油以及游离脂肪酸（free fatty acid ， FFA ）（两种主要杂质）从而获得高纯度的MELs ，分离过程可以回收90%以上的MELs ，纯度约为100%，且所产MELs 具有优异的表面活性（在15 mg ·L -1
浓度下
注：meso-Erythritol —赤藓醇；Emt1—糖基转移酶；Mac1、Mac2—酰基转移酶；Mat1—乙酰基转移酶；n ＝6或8。ME —甘露糖基赤藓糖醇；MEL -D —脱乙酰化甘露糖基赤藓糖醇脂质；MEL -C —4'-乙酰化甘露糖基赤藓糖醇脂质[9]。
图2 甘露糖基赤藓糖醇脂的合成途径
Fig. 2 Lipid synthesis pathway of mannosyl erythritol
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将水的表面张力降低到28 mN·m-1以下）和高乳化活性（85%~96%）。这种高效且易于操作的分离过程更适宜MELs在高纯度需求领域的工业生产。
2.3 MELs的分离定性
2.3.1 MELs的薄层谱分离法 薄层谱法（TLC）是一种吸附薄层谱分离法，因各成分对同一吸附剂吸附能力不同，使流动相（溶剂）在流过固定相（吸附剂）的过程中，连续产生吸附、解吸附、再吸附、再解吸附，从而达到各成分互相分离的目的。在这项技术中展开剂和显剂的选择尤为重要，目前使用最多的展开剂为氯仿∶甲醇∶氢氧化铵（体积比=65∶15∶2）［12，15-16］，显剂为蒽酮-硫酸溶液，根据产物不同或学者的理解不同对于烘烤温度和时间选择不尽相同，其中温度范围在
90~100℃之间，时间在5~10 min之间。另有一部分研究选择氯仿∶甲醇∶水体系作为展开剂（体积比为80∶15∶2［17］或70∶15∶2［5］），显剂选用蒽酮-硫酸或地衣酚-硫酸溶液。由此可得出，在MELs 的定性分析中，硫酸是显剂所必备的，氯仿和甲醇是展开剂所必须的。
2.3.2 MELs分离定性的其他方法 高效液相谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）与经典液相谱相比具有分析速度快、分离效能高、灵敏度高、柱子可反复使用的优点，但也具有“柱外效应”，如果流动相的流型有变化，被分离物质的微小扩散和滞留都会严重导致谱峰加宽，从而使柱效率降低。同时，HPLC鉴定不同物质采用的缓冲液不一样［5］。
除此之外，还可以利用近红外光谱（near infrared spectrum， NIR）在800~3 000 nm波长内对MELs
发酵液进行测量［1］，通过校正模型的建立实现对MELs发酵液样本的定性和定量分析。该方法与HPLC相比具有时间短、样品无需预处理、可多组分同时检测、成本低等优势，但弊端是灵敏度低、相对误差较大、检测范围较小。荧光发射光谱
针对于以上两种方式的优缺点，有学者提出谱-质谱联用法、气象谱-傅里叶变换红外光谱联用（gas chromatography-fourier transform infrared spectroscopy， GC-FTIR）、气象谱-核磁共振联用（GC-magnetic resonance imaging，GC-NMR）等联用的方式，这些联用方式灵敏度高、扫描快、有准确分子量和大量的标准图谱可查，高效地解决了单个方式所遇到的问题。相较于传统的分离定性的方法，使用现代技术的分析仪更加快捷方便，所测结果也更准确。
3 MELs的生产
3.1 MELs生产菌株
MELs是一种新型的非离子型生物表面活性剂，大多数是Pseudozyma属代谢物，少数是Ustila⁃go属代谢物。MELs虽作为微生物代谢产物却也具有着显著、广谱的抗菌活性，培养环境中MELs 的积累会抑制菌株生长，推测高浓度MELs耐受菌株可能与其细胞壁成分不同，故可通过对比不同菌株细胞壁成分了解高水平MELs耐受能力的原因，为提高产量提供新的方法。表1总结了MELs的主要产生菌株及主产类型。此外，MELs 在酵母细胞中充当类似于三酰基甘油的能量储存材料，由于MELs的合成与生
长无关，因此也可以通过使用酵母的静息（固定相）细胞进行生产。
表1 常见的MELs生物来源及所产类型Table 1 Biological sources and types of common MELs
菌株种类
P. antarctica
P. churashimeensis
P. fusiformata
P. parantarctica体育学刊
P. aphids
P. rugulosa
南极假单胞杆菌
P. crassa
P. tsukubaensis
P. hubeiensis
P. graminicola
P. siamensis
P. shanxiensis
湖北锥菌SY62
P. antractia PYCC 5048
P. aphidis PYCC 5535
P. antarctious
Ustilago scitaminee
Ustilago maydis
Uredo cynodontis
P. siamensis CBS 9906
主产类型
MEL-A
MEL-A
MEL-A
MEL-A
MEL-A
MEL-A
MEL-A
MEL-A,-B
MEL-B
MEL-C
MEL-C
MEL-C
MEL-C
MEL-C
MELs
MELs
MEL-C,-D
台风蒲公英生成MEL-A,-B
MEL-A,-B,-C
MEL-C
MEL-C
参考文献
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庵埠中学
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3.2 MELs的生产工艺
3.2.1 MELs生产菌株的定向改造 近年来，为使MELs满足生物技术、化妆品和制药工业等方面的需求，针对其相关基因簇展开多项研究也取得了一些进展。2018年，Masaaki等［10］通过构建SY 62的Mat1敲除突变体选择性地生产MEL-D并获得了一种新型的MELs衍生物——三酰化MEL-D，为开发特定的MELs衍生物提供了借鉴。2020年，Azusa等［18］使用基因缺失菌株对每一种代谢酶进行研究，发现了酰基辅酶A和乙酰基转移的顺序以及PtMAC1p和PtMAC2p的区域选择性，并对PtMMFlp的功能进行评估，推测PtMMFlp是一种转运体，可以将单酰化的MELs带到PtMAC2p和酰基辅酶A共存的反应场，或者将酰基辅酶A带到PtMAC2p与单酰化MELs共存的反应场，为MELs生物合成研究提供了新的思路。2021年，Fabienne等［19］发现Mac酶可以自由组合形成具有自定义酰化模式的MELs，利用此方法产生具有实质上不同特征的MELs。2022年，Tran等［20］围绕工程酵母菌株获得emt1、
mmf1和mat1 3种与MELs产生相关的过表达基因的转化子，实现MELs收率达到27.9 g·L-1，比野生型菌株高31.6%，为MELs大规模生产提供数据支持。
3.2.2 MELs的发酵参数优化 MELs生产过程中的各种参数如碳源、氮源、温度等相互作用会影响MELs的生产动力学。当菌株处于氮源限制条件下，可代谢合成MELs，但MELS的规模化生产仍存在产量低、成本高的问题。目前有研究通过间歇饲喂甘油、补料间接培养和改变培养基结构等方式尝试实现降本增产。
在培养基整体优化方面，MELs的基础培养基为：23.0 g·L-1NaNO3，0.2~0.3 g·L-1KH2PO4，1.0~ 5.0 g·L-1酵母提取物，0.2~0.3 g·L-1 MgSO4·7H2O。在此培养基基础上，Leu等［1］设计了GL培养基（4.00%大豆油，8.50%葡萄糖，0.20% NaNO3，0.01%镁和0.25%酵母提取物），Liang等［14］设计了种子培养基（4.0 g葡萄糖，3.0 g NaNO3，0.3 g MgSO4·7H2O，1.0 g酵母提取物）。从上述两种培养基可得出，对于MELs的培养，硝酸钠、含镁化合物和酵母提取物是必不可少的原料，而这也为后续营养结构的改变奠定了基础。2015年，范琳琳等［5］利用Plackett-Burman设计和中心组合
设计及响应面法，获得了产量可达80.0 g·L-1的高产培养基。该培养基成分为：大豆油96.8 mL·L-1，酵母提取物1.5 g·L-1，蛋白胨1.0 g·L-1，NaNO3
1.5g·L-1，MgSO4·7H2O 0.6 g·L-1，MnSO40.1 g·L-1，CaCl2 0.03 g·L-1。
在培养基单元优化方面，范琳琳等［5］首次采用RNA-seq Denovo和DGE测序技术相结合的方法，获得的菌株P. aphidis在氮源限制（无硝酸钠）的条件下代谢合成MELs的表达图谱显示与MELs合成相关的糖基转移酶Emt1、无机盐运输蛋白等有不同程度的上调，而编码氨基酸、肽、含氮化合物等基因出现下调，氮源饥饿下MELs产量有所减少，同时产生副产物纤维二糖脂（cellobiose lipid， CLs）、表面无机氮对于MELs的合成至关重要。此外，还利用木薯加工业副产品——木薯废水作为碳源，实验表明用木薯废水作为培养基与使用水溶性碳源培养基的效果相似，从而可降低MELs生产的成本。
目前，Miguel等［19］首次利用β-半乳糖苷酶可以分解D-乳糖这一特性，直接从奶酪工业副产品——奶酪乳清中生产MELs。该工艺中MELs的产量达1.51~1.92 g·L-1·d-1，与含酵母提取物培养基的产量1.40~1.31 g·L-1·d-1非常接近，该实验将复杂的MELs培养基简化为单一的廉价底物。3.2.3 MELs的生产方式 补料分批培养是MELs 目前生产最有效的方法之一。Masaaki等［21］研究表明P. hubeiensis KM-59菌株培养第4天时MELs 产量达21.8 g·L-1，随后，MELs的含量显著下降到10 g·L-1以下。但在初始阶段分别加入大豆油（a）、大豆油与酵母提取物（b）和大豆油、酵母提取物与葡萄糖（c）培养，产量随时间延长而增加（图3）。其中大豆油、酵母提取物和葡萄糖组时间培养时间延长至16 d且产量达74.3 g·L-1。Rau等［22］研究表明大豆油除作为必要碳源外，还可起到消泡剂的作用，能够减少泡沫产生，且不改变体系性能。当出泡后以0.3 g·L-1·h-1开始添加大豆油至36.7 g时停止供应，可显著提高MELs产率达75 g·L-1。目前，Yu等［23］获得了较完善的分批发酵方法，在初在烈日和暴雨下
始阶段，将大豆油浓度降低至20 g·L-1并添加葡萄糖20 g·L-1以提高初始阶段生物量，48 h内总糖的生物量和利用率显著增加，细胞进入固化阶段。在第二阶段，在培养48 h和
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