检测新方法及其应用研究
合肥工业大学学报研究生：米贤文
导师：王永生教授
摘要
DNA加合物是化学毒物经生物转化后的亲电活性产物与DNA分子形成的共价结合物，它既是一种暴露标志物，又是一种效应标志物。8-羟基脱氧鸟苷是DNA损伤生物标志物中最有代表性的一种。建立8-羟基脱氧鸟苷的检测新方法具有重要的生物医学意义。 在本文第二章，用共振光散射技术建立了8-羟基脱氧鸟苷的检测新方法。研究表明：在pH9.0的R.B缓冲液中，吡啰红Y阳离子染料与8-羟基脱氧鸟苷阴离子形成离子缔合物，导致体系的共振光散射增强。在优化的实验条件下，体系的共振光散射强度随着8-羟基脱氧鸟苷的加入在339nm处急剧增强。共振光散射的增强(△I RLS)与8-羟基脱氧鸟苷浓度成线性关系，据此建立8-羟基脱氧鸟苷的共振光散射检测新方法，方法的线性范围为50.0~226.4ng/ml，检出限为15.2ng/ml，RSD=8.8%，平均加标回收率=94.6%。
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在本文第三章，用能量转移技术建立了鱼精蛋白荧光猝灭法检测8-羟基脱氧鸟苷的新方法。在25℃、pH8.2的Tris-HCl缓冲溶液中，在0.50~7.1μg/ml 范围内，8-羟基脱氧鸟苷浓度与鱼精蛋白的荧光猝灭强度成线性关系，r=0.9963, 方法的检出限为0.18μg/ml，RSD=6.2%，平均加标回收率为104%(n=6)。
在本文第四章，应用荧光光谱法研究了8-羟基脱氧鸟苷与鱼精蛋白的作用机制。实验表明，8-羟基脱氧鸟苷与鱼精蛋白的相互结合作用为静态荧光猝灭过程；
8-羟基脱氧鸟苷与鱼精蛋白的结合常数(K A)为3.10×104L•mol-1(t=25℃)；根据FÖrster非辐射能量转移理论，确定供体－受体之间的距离(r)为3.47nm，能量转移效率(E)为0.24，鱼精蛋白与8-羟基脱氧鸟苷的作用力主要为静电引力。采用同步荧光光谱法研究了8-羟基脱氧鸟苷对鱼精蛋白构象的影响。
关键词：生物标志物，8-羟基脱氧鸟苷，共振光散射，荧光猝灭，能量转移，鱼精蛋白，吡啰红Y
Novel Detection Methods of 8-Hydroxy-2’- deoxyguanosine as a Biomarker of DNA Damage and Their Application
ABSTRACT
xscaleDNA adduct is a covalent complex formed by DNA and electrophilic activity production of toxicologic
al chemicals transformed in body, and it is not only an exposure biomarker but also an effect biomarker. 8-Hydroxy-2’-deoxyguanosine is one of the most representative biomarkers of oxidative DNA damage. To develop novel detection method for 8-hydroxy-2’-deoxyguanosine has important medical significance.
In the chapter 2, a new detection method has been developed with th technology of Resonance Light Scattering. It is found that the intensity of system’s Reso nance Light Scattering (RLS) is significantly enhanced duo to the formation of ion-association complex of 8-hydroxy-2’-deoxyguanosine (8-OHdG) anion with Pyronine Y cation in the pH9.0 buffer. Under the optimal experimental conditions, a new RLS determination for 8-OHdG was developed based on the enhancement(△I RLS) of the system’s RLS intensity at 339nm, which is linear to the concentration of 8-OHdG in the range of 50.0~226.4ng/ml. The detection limit is15.2ng/ml. The proposed method succeeded in the determination of spiked samples with simple and sensitive characteristic.
In the chapter 3, a new detection method for 8- hydroxy-2’-deoxyguanosine has been developed with technology of fluorescence resonance energy transfer based on the fluorescence quenching effect. The fluorescent quenching intensity of protamine sulfate(Ps) at 301nm is linear to the concentration of 8-OHdG in the range of 0.50~7.10μg/ml, at 25℃, in the pH8.2 Tris-HCl buffer soluti
on with the detection limit of 0.18μg/ml. The relative standard deviation was 6.2% and average recovery was 104%(n=6). The proposed method is simple and sensitive, succeeded in the
spiked urine sample with satisfaction.
In the chapter 4, the mechanism of interaction between Ps and 8-OHdG has been studed by spectrofluorometric method. It is proved that static quenching exist between 8-OHdG and Ps. The results show that the combination constant K A is 3.10×104 L/mol. The binding distance(r)between 8-OHdG and Ps is 3.47nm and the energy transfer efficiency (E) is 0.24 based on Förster's nonradiative energy transfer theory. The effect of 8-OHdG on the conformation of Ps was further analyzed with synchronous fluorescence spectroscopy.
Postgraduate: Xianwen Mi (Health Toxicology)中公教育黑龙江分校
Directed by Prof.:Yongsheng Wang
Key words: Biomarker, 8- Hydroxy-2’-deoxyguanosine, Resonance light
scattering, Fluorescence quenching, Energy transformation,
Protamine sulfate, Pyronine Y
第一章前言
1.生物标志物的定义
生物标志物(Biological Markers)是能够反应致病因素或毒物从暴露到效应过程各环节性质的特异性分子。通过测量体液、组织或整个生物体，能表征化学污染物暴露和其效应在生理、生化、免疫、遗传等方面的分子水平的物质改变。概括地讲，生物标志物就是衡量环境污染物的暴露及效应的生物反应[1]。 生物标志物分类方法有两种:
①根据表型和基因型的特点分为表型生物标记物和基因型生物标志物。表型生物标志物包括蛋白质、糖类、脂质、多肽和其他血清或体液中可以检测到的特异性分子。基因型生物标志物包括基因类型、基因突变型、DNA加合物、DNA 多态性。
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②根据致病因子作用机体的过程，也就是从功能上分为接触标志物、效应标志物和敏感性标志物。
接触标志物是指示生物对污染物的暴露，即污染物引发生物体反应，如指示对重金属暴露的金属硫蛋白(metallothioneins, MTs) [2]。这类生物标志物不能指示污染物的毒性效应，但有助于研究化学分析方法难于检测到的、环境中不稳定的化合物的暴露。效应标志物指示污染物对生物体健康状况的损害
效应，可以是疾病的损害，也可以是功能容量的改变。在环境毒理学中，这类生物标志物具有重要的作用，它可以解释污染物毒性效应的分子反应机理，从而科学地评价环境污染物对生物体的作用［3］。如指示DNA损伤的DNA加合物(DNA adducts)，它是生物体DNA通过共价键与亲电性环境污染物结合的产物，是机体内源性成分的改变。敏感性标志物指示生物个体对环境污染物的敏感性。污染物与机体的相互作用过程中，个体因素决定了机体对相同性质、剂量污染物的不同反应表征［4］。通过测定真菌的过氧化氢酶、维生素C、谷光甘肽酶的活性，可以评价其抗氧化的能力。在各个层次的生物组织中，从微观分子，到生态系统，在污染物作用下，都有各自对应的污染效应和生物标志物。分子水平和细胞水平生物标志物的研究具有重
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