摘要 蛋白质的磷酸化修饰是最重要、存在最广泛的一种蛋白翻译后修饰方式，蛋白质磷酸化修饰几乎参与所有的关键生命活动过程。磷酸化蛋白质组学主要研究磷酸化蛋白的鉴定、精确的绘图、磷酸化位点的定位、磷酸化水平的定量，并最终揭示其生物学功能。该文在简要地介绍了磷酸化蛋白质组学技术的基础上，主要分析了植物中磷酸化蛋白质组学的研究进展，并总结了植物磷酸化蛋白质组学的研究前景。 关键词 植物；磷酸化；磷酸化蛋白质组学
翻译后修饰（Post-translational modification，PTM）对调控蛋白结构和功能十分重要，蛋白质能够被不同的化学残基在多个位点调控。因此，蛋白质的PTMs大幅度增加了蛋白质组的复杂性[1-2]垂直与平行教学设计。在PTMs中，蛋白质的磷酸化是最重要和最具特点的[1-4]。细胞过程通过去磷酸化、蛋白激酶（PKs）和磷酸酶的识别被多种途径调控。蛋白质的磷酸化和去磷酸化的特意位点在蛋白结构、活性、稳定性、亚细胞定位和与其他生物分子相互作用方面都有重大的效应。例如，磷酸化可以为特异的结构域创造结合位点，例如14-3-3结构域[5]。在真核系统中，蛋白磷酸化主要发生在丝氨酸（S）、苏氨酸（T）和酪氨酸（Y）残基上，且丝氨酸和
苏氨酸残基磷酸化的出现比酪氨酸更加频繁。根据最近在拟南芥的大规模磷酸化研究中，pS、pT、pY的相关丰度被预计分别为85%、10.7%和4.4%[6]，与人类磷酸化蛋白的特征相似[7-9]。
在植物中，发现蛋白磷酸化过程与组织感应光、病原入侵、激素、温度胁迫和营养缺乏等不同的内外部信号有关[10-12]。通过磷酸化蛋白质组系统分析植物在特异生物应答中的激酶及其激活与产生磷酸化蛋白，将为植物生物学过程的大范围调节提供新的思路。
1 植物磷酸化蛋白质组学研究
1.1 发育的种子中存在大量磷酸化蛋白
新奥法
Agrawal等对发育的油菜籽的磷酸化蛋白质进行了系统的定量[13]，首次就植物磷酸化蛋白质进行大规模定量分析。其中用高分辨率的2-DE通过磷酸化蛋白特异的Pro-Q DPS和LC-MS/MS，鉴定出在种子填充阶段表达的磷酸化蛋白质的存在。Agrawal等首次鉴定出的磷酸化代谢酶有微管蛋白β-8支链、细胞腔结合蛋白、热激蛋白、蛋白酶体蛋白、14-3-3蛋白、膜联蛋白和储藏蛋白cruciferin的亚基，并揭示了在已鉴定的磷酸化蛋白中有44%以上
的酶参与了各种代谢途径，暗示了目前的植物代谢调节方面的研究可能仅仅是个开端[14]。
1.2 盐胁迫、核染质相关蛋白和细胞分化的磷酸化蛋白质组分析
Chitteti和Peng利用2-DE磷酸化蛋白质组的研究方法来鉴定水稻根系盐胁迫下的差异调控磷酸化蛋白[15]。鉴定出38个磷酸化蛋白表现出差异表达，其中20个为上调，18个为下调点，利用MS分析了其中17个上调和11个下调斑点。其中上调磷酸化蛋白包括核糖体蛋白S29、HSP70（dnak-type molecular chaperone）、GST、丙酮酸脱羧化酶同工酶2和小GTP结合蛋白OsRac2。在核染质相关蛋白的分析中，采用了一种从水稻悬浮培养的细胞中分离核染质的改进的磷酸化蛋白质组学研究方法，利用2-DE和shotgun蛋白质组研究方法联用，最终应用MS鉴定了共509个蛋白质斑点，269个非冗余蛋白[16]房地产信息化。Chitteti等为研究拟南芥细胞去分化过程中的磷酸化蛋白质组的变化，以拟南芥子叶为材料，分析鉴定了53个假定磷酸化蛋白质[17]。在这53个斑点中有9个在细胞去分化过程中差异表达。这些磷酸化蛋白在翻译水平被类锚定蛋白、叶绿素a/b结合蛋白2、14-3-3蛋白、ATP合成γ支链1、细胞分化ftsH同源蛋白等蛋白所调控。
1.3 植物中的酪氨酸磷酸化
Sugiyama等对拟南芥磷酸化的研究中强调拟南芥的酪氨酸磷酸化程度与人磷酸化蛋白质组十分相近[6]。在1 346个蛋白上共有2 172个非冗余磷酸化位点，其中磷酸丝氨酸、磷酸苏氨酸和磷酸酪氨酸的相对丰度分别为85.0%、10.6%和4.3%。在人磷酸化蛋白质组中，不同样品的磷酸酪氨酸的相对比例被报道为1.8%～6.0%[7-9]。值得注意的是，大多数磷酸化肽段包含的酪氨酸发现被多次磷酸化，且此酪氨酸磷酸化残基似乎发生在其他磷酸化残基附近。人类和拟南芥的磷酸化蛋白质组中酪氨酸磷酸化程度惊人的相似性暗示通常在植物中，至少在拟南芥中，酪氨酸磷酸化是十分重要的。
1.4 胞质核糖体磷酸化蛋白质组学鉴定RPS6和酸性蛋白
1-DE/Pro-Q DPS/TiO2磷酸化肽段富集蛋白质组学研究方法被应用于拟南芥胞质核糖体蛋白磷酸化程度的系统研究中[18]。利用1-DE/Pro-Q DPS/MS分析鉴定了RPS6和RPL13等6个核糖体蛋白。TiO2/nano-LC-MS/MS进一步鉴定了共7个磷酸化蛋白。这些被鉴定的蛋白大部分是酸性核糖体蛋白家族中的成员，如P0、P1、P2、P3、RPS6和RPL13。在此研究中，这些蛋白的丝氨酸残基也被认为是潜在的磷酸化位点。
1.5 胁迫下质膜水通道蛋白磷酸化状态变化的定量
水通道蛋白作为通道蛋白参与调解水、中性溶剂的跨膜运输，有时也参与响应非生物胁迫的离子跨膜运输，在生物体内无处不在[19]。据报道，磷酸化丝氨酸残基出现在多种植物的水通道蛋白的N和C端尾部[20]。
Prak等将定量磷酸化蛋白质组学和细胞生物学方法结合，进一步研究了拟南芥根部水通道蛋白的磷酸化与响应NaCl和H2O2处理的根透水性有怎样的关系。共鉴定出6个在几种拟南芥质膜内在蛋白（AtPIPs）C端尾部的新磷酸化位点。通过相对定量的方法鉴定出AtPIP2；1位于C端2个的磷酸化位点，Ser280和Ser283。为了验证水通道蛋白亚细胞运输中Ser280和Ser283磷酸化的作用，在AtPIP2；1的2个位点的其中一个形成突变，然后与GFP融合并在转基因植株中超表达。这些植株的共聚焦显微分析揭示了Ser283的磷酸化对AtPIP2；1锚定质膜十分重要。1.6 响应普通诱导子的早期信号和防御的质膜的蛋白和囊泡运输
包括跨越质膜的离子流、分裂素激活的PKs（MAPKs索引图像）和ROS的形成等早期信号事件，一般仅发生在几分钟之内。通过拟南芥悬浮培养细胞的14N/15N新陈代谢标记进行的定量的
磷酸化蛋白质组学方法被建立起来，以进行参与调控早期信号事件的磷酸化过程的观察[21]。在这种定量方法中，共鉴定出1 172个磷酸化肽段，其中包括1 011个新发现的磷酸化肽段。在木聚糖酶处理细胞中鉴定的所有磷酸化肽段中，近60%同时存在于经flg22处理的细胞中，说明在发现的磷酸化肽段中有大量的重叠，并且木聚糖酶和fla22诱导子由此可能共用一个信号途径。同时，在木聚糖酶和fla22处理对比下，共发现有76个膜相关蛋白和防御相关蛋白表现为差异磷酸化。另外，分别应答木聚糖酶和fla22的53和19个蛋白可能由不同的磷酸化途径调控。这些蛋白显示出一个或更多个在磷酸化位点上的质量变化，体现了在翻译后修饰水平的高度复杂性，例如RBOHD（respiratory burst oxidase protein D）的复杂调节模式。因此，早期信号和抵御诱导子的防御应答过程中蛋白和囊泡的运输起到非常重要的作用。
2 结语
在最近几年，几种利用MS进行的高通量蛋白质磷酸化分析的新技术推动了植物蛋白质磷酸化的系统研究，为植物特异磷酸化蛋白质组学数据库提供了网络资源，促进了生物信息学预测方法的发展。
尽管质谱及亲和层析等技术为磷酸化蛋白质组学分析提供了巨大的帮助，但目前在磷酸化蛋白质组学方面的所有技术仍面临许多难题，还有待改进。磷酸化蛋白在细胞内的含量仅占总蛋白非常小的比例。因此，在试验过程中，首先要求高效、重复性强的对磷酸化蛋白进行分离富集，还需要通过高灵敏性的质谱仪器进行精确的分析。另外，蛋白存在多种磷酸化修饰，且磷酸位点具有可变性，同时主要的磷酸化位点比次要磷酸化位点的可鉴定性要高很多。因此，需要开发全面、系统的磷酸化蛋白质组学研究技术来进行磷酸化蛋白质组学的研究。同时，尽管最近已在植物磷酸化蛋白质组学方面取得了一定的进展[10-11]，但与哺乳动物方面的相关研究相比，许多磷酸化残基的功能在哺乳动物信号转导研究的十分透彻，而植物的激酶活化途径、底物、调节特异性的原理却都知之甚少，而且都集中在特异性蛋白的磷酸化分析和特异信号途径的研究方面上[10]。因此，植物磷酸化蛋白质组学的研究要在不断比较与哺乳动物的异同性基础上，不断完善磷酸化蛋白的分离、富集技术，提高磷酸化蛋白、肽段的检测的灵敏性、准确性，才能更加细致深入、全面地对磷酸化蛋白质组学进行系统研究[22]。
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