于靖1，杨锡洪1,2，谢静雯1，卢宽1，解万翠1,2,3,4
（1.青岛科技大学海洋科学与生物工程学院，山东青岛 266042）（2.山东省生物化学工程重点实验室，山东青岛 266042）（3.青岛智科检验检测有限公司，山东青岛 266002）（4.青岛信和源生物科技有限公司，山东青岛 266002）摘要：降低组胺及提高风味是快速发酵虾酱产业化面临的瓶颈问题。为探讨甘氨酸对快速发酵虾酱中组胺生成的抑制作用及风味品质影响，本研究以新鲜虾头为原料，添加Pichia gilliermondii、Aspergillus niger及Lactobacillus planticola（1:3:5）的复合菌相发酵剂，检测添加甘氨酸后组胺含量变化，追踪对发酵过程中理化性质及安全指标影响，感官评定及电子鼻分析虾酱品质及风味。结果表明，甘氨酸的添加对组胺生成有良好的抑制作用，向虾酱中添加2%、4%和6%的甘氨酸分别使组胺含量降低了29.53%、31.16%和34.98%，随甘氨酸添加量的增加，虾酱中AA-N含量增加，pH降低，菌落总数维持在3.77~4.15 lg(cfu/g)之间，产品安全性良好。甘氨酸添加量为4%时，含硫化合物及芳香化合物传感器响应值增大，增强了虾酱的特征性风味，提高营养及感官风味水平。定量添加的甘氨酸，既提高了产品的风味品质，又在一定程度上降低了组胺含量，保障产品安全性。 关键词：甘氨酸；快速发酵；组胺；虾酱；电子鼻
虚拟博物馆文章篇号：1673-9078(2021)03-115-123 DOI: 10.13982/j.mfst.1673-9078.2021.
3.0707 Glycine Reduces the Histamine Content in the Fast-fermented Shrimp
Paste by Compound Bacteria
YU Jing1, YANG Xi-hong1,2, XIE Jing-wen1, LU Kuan1, XIE Wan-cui1,2,3,4
(1.College of Marine Science and Biological Engineering, Qingdao University of Science & Technology, Qingdao 266042,
China)(2.Key Laboratory of Biochemical Engineering of Shandong Province, Qingdao 266042, China)
(3.Qingdao Zhike Inspection and Testing Co. Ltd., Qingdao 266002, China)
(4.Qingdao Xinheyuan Biotechnology Co. Ltd., Qingdao 266002, China)
Abstract: Reducing histamine and improving flavor are the bottleneck problems in the industrialization of fast-fermented shrimp paste. In order to explore the inhibitory effect of glycine on the production of histamine in the fast-fermented shrimp paste and the effect on the flavor quality of the shrimp paste, this study used fresh shrimp heads as raw materials, with Pichia gilliermondii, Asp
ergillus niger and Lactobacillus planticola (1:3:5) as a compound fermentation agent. The changes in histamine content after the addition of glycine were examined, with the effects on the physicochemical properties and safety indicators during fermentation being tracked. The quality and flavor of shrimp paste were analyzed by sensory evaluation and electronic nose. The results showed that the addition of glycine had a significant inhibitory effect on histamine production. The addition of 2%, 4% or 6% of glycine to the shrimp paste reduced the histamine content by 29.53%, 31.16% and 34.98%, respectively. With an increase in the amount of glycine added, the content of AA-N in the shrimp paste increased. As the pH decreased, the total number of colonies was maintained in the range of 3.77~4.15 lg (cfu/g), while the product safety remained good. When the addition amount of glycine was 4%, the sensor response values of sulfur compounds and aromatic compounds increased, which enhanced the characteristic flavor of shrimp paste and improved the nutritional value and sensory flavor. The quantitative addition of glycine not only 引文格式：
于靖，杨锡洪，谢静雯，等.甘氨酸降低复合菌快速发酵虾酱中的组胺含量[J].现代食品科技,2021,37(3):115-123
YU Jing, Y ANG Xi-hong, XIE Jing-wen, et al. Glycine reduces the histamine content in the fast-fermented shrimp paste by compound bacteria [J]. Modern Food Science and Technology, 2021, 37(
3): 115-123
收稿日期：2020-07-26
基金项目：国家自然科学基金项目（31671825；32072348）；山东省重点研发计划项目（2017GHY15127）
作者简介：于靖（1997-），女，在读硕士，研究方向：食品营养与安全
通讯作者：解万翠（1969-），女，博士，教授，研究方向：食品风味与安全
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improves the flavor quality of the product, but also reduces the histamine content to a certain extent to ensure product safety.mmpp
Key words:glycine; rapid fermentation; histamine; shrimp paste; electronic nose
虾酱（shrimp paste）是中国沿海地区以及马来西亚、新加坡、泰国等东南亚国家常见的海鲜调味品[1]，以毛虾、蜢子虾等小型虾类及虾产品加工下脚料为原料，经虾体和细菌中蛋白酶对原料蛋白的水
南京邮电大学张代远解，释放出氨基酸和肽，从而赋于产品特定的鲜美风味[2]。因其营养丰富，含蛋白质、维生素及DHA、EP A等具有调节血脂、免疫及补脑健脑功能的不饱和脂肪酸[3]，深受消费者喜爱。然而虾酱作为一种天然发酵产品，其发酵周期长，微生物区系复杂多变，发酵过程受多种因素影响，品质不稳定，可能存在一定的安全性问题[3]。
生物胺（Biogenic amine，BAs）是一类低分子含氮有机化合物[4]，广泛存在于蛋白含量丰富的发酵水产品中，是致癌性亚硝胺的前体物质，主要包括腐胺、酪胺、胺、尸胺、组胺、苯乙胺、精胺和亚精胺等。其中组胺对人类健康影响最大[5]，通过与细胞膜上的受体作用发挥毒性，易造成低血压、头痛、呕吐和腹泻等不适症状，甚至导致人体神经系统和心血管系统损伤[6]。虾酱发酵过程中虾体原料经产蛋白酶菌作用被降解为氨基酸后，在微生物代谢产生的氨基酸脱羧酶作用下发生脱羧反应，因而产生相对大量的生物胺，严重影响虾酱产品的食用安全性[7]，给消费者带来健康风险。因此，在保持虾酱传统风味的同时寻求有效的降组胺方法对于提高发酵食品安全性及产品质量具有一定的现实意义。
食品添加剂，如盐、酸化剂和甜味剂等已被报道，用以抑制或刺激生物胺的形成，国内外学者在研究海鲜调味品快速发酵工艺优化时发现[8,9]，外源氨基酸对海鲜发酵调味品的安全性及风味具有良好的促进作用，Jae-Hyung Mah[10]等经研究腌制凤尾鱼发现，甘氨酸是体外抑制微生物产胺活性最有效的食品添加剂，添加5%甘氨酸能使发酵凤尾鱼中组胺含量降低86%，并且甘氨酸对生物胺产生的抑制
作用可能与其浓度成正比。
换一种方式飞行本课题组前期经定向分离、筛选发酵菌种，在外加微生物法快速发酵虾酱的基础上，添加不同含量甘氨酸，研究其对快速发酵虾酱中组胺的抑制作用，综合菌落总数判断虾酱产品安全性，同时进行感官评价及电子鼻检测，对挥发性盐基氮(TVB-N)和氨基酸态氮（AA-N）等理化指标进行分析，探讨甘氨酸对快速发酵虾头酱组胺含量和风味品质影响。
1 材料与方法 1.1 材料与试剂
虾头：新鲜凡纳滨对虾虾头(Litopenaeus vannamei)，湛江国联水产开发股份有限公司；发酵菌种：季氏毕赤氏酵母（Pichia gilliermondii）、黑曲霉（Aspergillus niger）、植物乳杆菌（Lactobacillus planticola），实验室前期分离自广东传统虾酱；磷酸组胺：生物试剂（≥98.0），南京奥多福尼生物科技有限公司；甘氨酸：生物试剂，天津市福晨化学试剂厂；氢氧化钠：优级纯，天津广成化学试剂有限公司；平板计数琼脂（PCA）培养基：生物试剂，西陇化工股份有限公司；三：分析纯，上海凌峰化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
可见分光光度计（V-5000），上海元析仪器有限公司；立式蒸汽灭菌器（LDZX-30KBS），上海申安
医疗器械厂；pH计（PHS-3C），上海仪电科学仪器股份有限公司；净化工作台（SW-CJ-270），上海实业有限公司医疗设备厂；恒温培养箱（SPX-250B-Z），上海实业有限公司医疗设备厂；电子鼻分析系统：北京盈盛恒泰科技有限责任公司。
1.3 实验方法
1.3.1 虾酱快速发酵工艺
快速发酵工艺流程如图1所示，新鲜虾头洗净沥水、减去毛须后称重，巴氏灭菌法（75 ℃，30 min）低温灭菌，虾头打浆后置于发酵罐（500 g），加入虾头重量18%的食盐，接入复合发酵剂（季氏毕赤氏酵母：黑曲霉：植物乳杆菌=1:3:5），同时添加2%、4%和6%的甘氨酸，在37 ℃下恒温发酵20 d，每48 h搅拌样品并取样保存于-20 ℃冰箱待测。
图1 虾头酱快速发酵流程
Fig.1 Rapid fermentation process for shrimp head sauce
116
表1 虾酱感官评分标准
Table 1 Standards for sensory evaluation of shrimp paste
评分泽气味滋味质感
9~10
红或紫红，
表面鲜亮，有光泽
浓郁的发酵虾酱气味
鲜味浓郁醇厚，咸度适中，
无异味，刺激食欲
质地均匀，口感细腻，
稠度适中，虾肉富含弹性
7~9 红、褐，光泽较淡发酵香味下降，但无异味鲜味较浓，咸淡适中，
无异味，刺激食欲
质地较均匀，口感较细腻，
稠度适中，虾肉稍带有弹性
6~7 红、褐，光泽暗淡发酵香味较淡，且带有异味鲜味较淡，稍带异味粘稠度较低，口感较粗糙
< 6 酱发乌、发黑无香味，虾酱发臭鲜味寡淡，过淡或过咸，
腥味、有苦或其他异味
成分大小混杂，过稠或过稀，
虾肉松散或坚硬广东省养老保险条例
表2 电子鼻传感器性能描述
Table 2 Performance of six sensors for electronic nose
传感器名称性能描述气体浓度/(mL·m3）W1C 对芳香族有机化合物敏感甲苯10
W5S 对氮氧化物反应灵敏NO2 1 W3C 对胺类、芳香成分灵敏苯10
W6S 主要对氢化物有选择性H2 100 W5C 主要检测短链烷烃芳香成分丙烷 1
W1S 对甲基类灵敏CH4 100 W1W 对无机硫化物灵敏H2S 1 W2S 对醇类、醛酮类灵敏CO 100 W2W 对芳香成分、有机硫化物灵敏H2S 1 W3S 用于烷烃高浓度检测，对甲烷敏感CH4 10
1.3.2 理化指标检测及菌落总数测定
pH测定：参考GB 5009.237-2016以及Techaratanakrai[11]的方法：将10.0 g样品用新煮沸冷却的超纯水定容至100 mL，静置30 min，6000 r/min均质2 min，过滤后采用酸度计测定。TVB-N含量检测：参考《GB 5009.228-2016食品安全国家标准食品中挥发性盐基氮的测定》进行检测；氨基态氮含量：参考《GB 5009.235-2016 食品安全国家标准食品中氨基酸态氮的测定》进行含量分析；菌落总数：根据《GB 4789.2-2016 食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》进行测定。
1.3.3 组胺含量测定
5.0 g虾酱样品与20 mL 10%的三于具塞三角瓶中摇匀，55 ℃超声20 min，间隔5 min震荡，过滤后残渣用10 mL的蒸馏水冲洗3次，合并滤液，氢氧化钠溶液（250 g/L）调pH至5.00±0.02，定容至100 mL。根据赵宇明的方法[12]取样测定。（标准曲线：y=0.01719x+0.01729，R2=0.99934）
1.3.4 感官评价
在感官评价过程中，由于品尝结果受主观因素（如年龄、生活经历、文化背景、地理区域、感觉差异等）影响较大[13]，结果缺乏足够的科学性。本文采用描述性定量分析法（quantitative descriptiveanalysis，QDA）[14]对发酵成熟的虾酱进行感官评价。感官评定小组由
9名已进行感官培训后的成员组成，评估过程在感评室中进行，尽可能保持环境条件不变，同时为各位成员提供矿泉水，以消除不同样品之间的味觉干扰[15]。每位成员对样品的风味特征（虾味、发酵味、咸味、鲜味、腥味、苦涩味、氨气味以及体态等方面）进行评分，评分标准见表1。评分包括0~9分，总计10个分数，“0”表示没感受到该风味，“9”则表示此风味浓郁，综合得分=滋味均分×0.4+香气均分×0.6。
1.3.5 电子鼻分析
使用电子鼻系统（PEN3，Airsense Analytics GmbH，德国）检测不同甘氨酸含量虾酱中挥发性化合物。准确称量2.0 g样品于10 mL样品瓶中密封，室温稳定30 min，收集延迟时间为300 s，数据采集时间150 s，进气速度0.3 L/min，平行测定3次。传感器阵列对应物质如表2所示，由W1C、W5S、W3C、W6S、W5C、W1S、W1W、W2S、W2W、W3S 10个传感器组成。根据电子鼻的响应强度，考察虾酱样品中挥发性物质变化，仪器控制采用Winmuster软件。
1.4 数据统计与分析
117
118 本文感官评价的QDA图及其他数据通过origin
9.0分析，显著性通过SPSS 21.0进行分析。
2 结果与分析
2.1 甘氨酸对发酵过程TVB-N含量的影响
TVB-N是衡量水产调味品原料新鲜度和腐败变质程度的重要指标[16]。在虾酱发酵过程中，TVB-N含量与腐败微生物的活性呈正相关，是虾肉腐败臭味的主要来源，能够直接反映虾酱品质。图2为添加不同浓度甘氨酸对虾酱发酵过程中TVB-N含量影响。
图2 TVB-N的含量曲线
Fig.2 Change curve of TVB-N content
由于微生物在初期大量繁殖并迅速进入对数生长期，腐败微生物未被有效抑制，虾头酱中的蛋白质在内源酶作用下被迅速分解为氨基酸，经脱羧或脱氨反应生成挥发性的胺类及氨气等碱性含氮物质，导致0~2 d中TVB-N含量急剧上升。2~4 d上升速度减慢，到4 d时，TVB-N含量基本达到最高。由于微生
物和酶受体系中高温高盐环境影响，其活性降低，且一部分TVB-N在发酵过程中挥发[17]，导致4~14 d发酵中后期的含量呈平稳下降趋势。如图2所示，甘氨酸的添加未改变TVB-N的总体变化趋势，但促进了其在发酵中后期的生成，与对照组相比，添加了2%、4%和6%甘氨酸的样品在发酵成熟后TVB-N分别增加了17.58%、33.34%和36.67%，这种变化可能是由于外源甘氨酸经脱羧及脱氨反应产生了更多的挥发性胺类等碱性含氮物质[18]。虽然外源甘氨酸的添加使TVB-N 含量有所增加，但其仍远远低于SB/T 10525-2009中450 mg/100 g的限量标准，与吴小禾[19]等检测成品黄骅虾酱所测得TVB-N最高值401 mg/100 g相比，本实验产品具有一定的安全保障。
2.2 甘氨酸对虾头酱发酵过程AA-N含量的影响
氨基态氮（AA-N）是以氨基酸形式存在的氮元素的量，是判定鱼露、酱油、虾酱等发酵产品发酵程度的首要特性指标[20]，该指标越高，说明虾酱中的氨基酸含量越高，发酵效果越佳，鲜味物质越丰富。图3为加入不同浓度甘氨酸后虾头酱中AA-N含量变化。
甘氨酸作为一种甜味氨基酸，添加后使得虾酱中AA-N的含量大大增加。比较图3虾头酱中不同甘氨酸添加量的AA-N曲线走势可知，在发酵初期各组虾酱AA-N含量增长迅速，这种增长是由于原料虾头中的蛋白被内源酶和发酵剂产生的蛋白酶降解，使其分解成了氨基酸以及小分子肽等生香成分[21]。宋中辉等[22]在优化香辣虾酱配方时也发现，发酵初期氨基酸态氮增长较快，是由于发酵环境有利于微
生物参与发酵过程。随发酵时间的延长，高温高盐环境下抑制了大部分微生物的活性，引起酶分泌量和酶活力的降低，并且虾头酱中可以被水解的肽键含量也随之减少[23]，导致AA-N含量上升趋势减慢，含量逐渐达到平稳。
图3 甘氨酸对虾头酱发酵过程AA-N含量的影响
Fig.3 Effect of glycine on AA-N content in fermented shrimp
head sauce
2.3 甘氨酸对虾头酱发酵过程pH变化的影响
图4 甘氨酸对虾头酱发酵过程pH的变化影响
Fig.4 Effect of glycine on the change of pH of fermented shrimp
head sauce
pH反映虾酱酸碱性以及新鲜度，不仅影响发酵微生物的生长繁殖及发酵程度，也影响其代谢活力和代
119
谢方向，是影响组胺产生的重要环境因素[24]，Baranowski 等[25]发现，pH 的升高能大大降低产组胺微生物的活性及产酶能力，分离自金鱼体内的菌株在pH=4时将组氨酸转化为组胺的能力最强，而当pH=6时它的活力降低了30%。向虾头酱中添加不同含量甘氨酸后，其发酵过程中pH 值变化如图4所示。
陈丽丽等[26]以草鱼和鳗鱼内脏为原料进行鱼露发酵时发现，发酵前期发酵液中进行的生化反应最为剧烈，因而pH 值变化最为明显。图4中0~2 d 虾头酱pH 在8.20~8.80之间急剧下降，在发酵第2 d 降至最低点，其后又缓慢上升。发酵初期pH 降低是由于在此阶段产酸微生物比较活跃，发酵剂通过糖酵解将原料中的碳水化合物快速分解为磷酸、乳酸等酸性代谢物质[27]。随着发酵过程的进行，高温高盐环境导致微生物活性减弱，产酸速率下降，并且会有少量原料蛋白水解产生的氨基酸及含羰基端的多肽等物质转化成碱性的挥发性盐基氮，使得虾头酱pH 在发酵过程中呈上升趋势。由于甘氨酸的等电点pH 为5.97，偏酸性，使得甘氨酸添加组虾酱pH 值低于空白组，且随甘氨酸浓度的增加，pH 偏离空白值程度增大。由于在发酵体系中，呈味核苷酸的稳定性随pH 值变化而变化，pH 值偏高会直接影响产品的质量和风味[28]，而甘氨酸添加组pH 值整体低于空白组，故在一定程度上保障了产品风味品质。
2.4 添加甘氨酸对虾头酱发酵过程菌落总数的影响
菌落总数是发酵食品安全的重要监测指标，天然发酵虾酱其品质受外界环境条件影响，可能存在菌落总数超标等品质问题，而微生物菌结构往往也对虾酱的泽、质构、风味、安全等方面发挥关键作用[29]。
图5 甘氨酸对虾头酱菌落总数的影响
Fig.5 Effect of glycine on the total number of colonies in shrimp
head sauce
微生物是导致食品腐败变质的首要因素，且水产
品中微生物种类繁多、数量庞大，对微生物数量进行有效控制能够减缓产品的腐败变质[30]。发酵过程中，具有氨基酸脱羧酶活性的微生物以及微生物适宜生长的环境能够极大地影响组胺的产生和积累。如图5所示，4组样品菌落总数维持在3.77~4.15 lg(cfu/g)之间，甘氨酸添加组与对照组在菌落总数方面没有显著差异（p >0.05）。本批次产品发酵温度为37 ℃，盐含量高达18%，发酵过程中抑制了大部分不利于发酵的微生物的繁殖代谢，各组虾头酱中菌落总数均低于李丽华等[31]由新鲜脊尾白虾制作的虾酱中最低菌落总数4.7 lg(cfu/g)，确保了产品的食用安全性。
2.5 甘氨酸对发酵过程组胺含量影响
生物胺作为发酵食品中研究热点，主要包括酪胺、组胺、尸胺、腐胺四种，过量的生物胺会损害人体健康，其中组胺的毒性最大，Latorre-Moratalla 等[32-34]许多学者将组胺作为监测发酵产品安全的重要因素。图6为添加不同含量甘氨酸的虾酱组胺变化趋势。
图6 不同浓度甘氨酸对组胺的影响
内蒙讨吃调Fig.6 Effect of glycine at different concentrations on histamine
4组样品在发酵前2 d ，组胺含量陡增，这与发酵
剂中具有产组胺能力的乳酸菌以及虾头原有的产组胺微生物有关，2~4 d 组胺含量增长趋势放缓，4 d 后对照组组胺含量缓慢增加至发酵结束，组胺含量增加了1.05倍，而甘氨酸添加组随着发酵时期的延
长，组胺含量逐渐呈下降趋势，且在发酵14 d 后，组胺降低水平与甘氨酸添加量成正比，添加2%、4%、6%的甘氨酸分别能降低产品中29.53%、31.16%、34.98%的组胺。Jae-Hyung Mah [10]等采用外加甘氨酸法降低腌制凤尾鱼中生物胺含量时发现，与对照组相比，5%甘氨酸处理能使腐胺、尸胺、组胺、酪胺和亚精胺的含量降低26.7%、47.0%、86.0%、98.8%和94.4%，而10%甘氨酸组的生物胺含量分别降低了32.6%、78.4%、93.2%、100.0%和100.0%。可见，甘氨酸是一种能够明显降低生物胺含量的食品添加剂，并且其对生物胺的抑制作用与浓度成正比增加。
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