刘春波——12生工2——20120802224
摘 要：采用福林法、邻苯二甲醛衍生比法和甲醛法对牛奶中蛋白酶的活力进行测定，通过对测定结果的统计学分析和回收率试验 探究3种方法的差异。 结果表明：3种方法均能从不同角度反映出牛奶的蛋白酶活力。 福林法具有精确度和准确度高、重现性好等优点， 虽然操作复杂，但能够更为直接客观的反映出牛奶的蛋白酶活力，适合于牛奶中蛋白酶活力的精密测定；邻苯二甲醛衍生比法具有 较好的精确度和准确度，结果重现性好，反应时间短，但测定过程中由温度引起的十二烷基磺酸钠（SDS）溶解性问题对测定结果影响 较大，适合于不同样品间蛋白酶活力的精确比较；福林法虽然操作简便，但精确度和准确度较差，结果重现性不好，适合于牛奶中蛋白 酶活力的粗略性和比较性测定。 关键词：牛奶；蛋白酶；福林法；邻苯二甲醛衍生比法；甲醛法
前言：蛋白凝块现象是牛奶储存过程中较为常见的质 量问题[1，2]。 研究表明，蛋白凝块是由牛奶中的蛋白酶 水解乳蛋白生成肽、氨基酸所引起的[3-5]。 为了控制蛋 白酶引起的
质量问题，需要对牛奶中蛋白酶活力进行 测定。 酱曲、糙米、豆粕等的蛋白酶活力测定已有成熟 的方法[6-8]，而牛奶中蛋白酶活力的测定始终没有统一 的标准和方法。 据文献报道，采用的测定方法有甲醛 法[9]、邻苯二甲醛衍生法[10]和福林试剂法[11]，但对于不 同测定方法的比较却鲜有报道。 本研究选用福林法、邻苯二甲醛衍生法和甲醛法 这三种方法对牛奶中蛋白酶活力进行测定，评价选择 出更适合牛奶中蛋白酶活力的测定方法，为生产控和产品质量检测提供理论依据。
1.1 材料与试剂
市售UHT利乐砖纯牛奶； 福林试剂，L-苯丙氨 酸，L-酪氨酸，酪素（化学纯），无水碳酸钠，三， 十二烷基磺酸钠（SDS），四硼酸钠（分析纯），邻苯二甲 醛（化学纯），-巯基乙醇（分析纯）。
1.2 仪器与设备 TU-1901紫外可见分光光度计，LD4-2A低速离 心机，HWS-26电热恒温水浴锅，78HW-1恒温磁力搅 拌器，XK96-A快速混匀器，PHS-3C pH计。
1.3 方法
长春高新人才1.3.1 福林法测定牛奶中蛋白酶活力 参考GB/T 23527-2009的方法略作修改[12]。 此方 法原理是蛋白酶在一定的温度和pH下能够水解酪素 底物，产生含有酚基的氨基酸如酪氨酸，在碱性条件 下与福林试剂反应，生成钼蓝与钨蓝，通过紫外分光光度计测定，从而计算出蛋白酶的活力[13]。 分别取不同质量浓度的酪氨酸标准溶液（0，10， 20，30，40，50 mg/L）各1 mL，加入浓度为0.4 mol/L的 碳酸钠溶液5 mL， 福林试剂溶液1 mL， 显反应在 （40±0.2） ℃中持续20 min。将反应液取出后，在680 nm 下测定其吸光度。 根据酪氨酸不同浓度对应的吸光度 值绘制标准曲线。 取1 mL待测牛奶样品，加入10 g/L的酪素溶液 1 mL，在（40±0.2） ℃下反应10 min，取出静置后过滤。 再取滤液1 mL，与5 mL的碳酸钠溶液、1 mL的福林试 剂混合后，在（40±0.2） ℃下显20 min，于680 nm下 测定其吸光度。 空白组测定方法相同，只是在加入酪 素之前先加入三使蛋白酶失活。 牛奶中蛋白酶 活力为 X=AK×4/10， 式中：X为牛奶样品的蛋白酶活力（u/mL）；A为牛 奶样品的吸光度；K为吸光常数（即根据回归方程计算 出当吸光度为1时的酪氨酸的量）；4为反应试剂的总 体积；10为反应时间。
1.3.2 邻苯二甲醛衍生比法测定牛奶中蛋白酶活力 参考Church[14]和张艳[10]的方法略作修改。 此方法 的原理是邻苯二甲醛衍生试剂在碱性介质中与游离 氨基酸反应生成异吲哚
衍生物，在340 nm下有特征吸 收， 通过测定吸光度计算出牛奶中游离氨基氮的浓 度，以此反映出蛋白酶的活力。 将40 mg的邻苯二甲醛溶于1 mL甲醇中， 分别加 入25 mL浓度为100 mmol/L的四硼酸钠、2.5 mL10%的 SDS、100 L的 -巯基乙醇，加水定容至50 mL，即为邻 苯二甲醛衍生试剂（OPA）。 分别取不同浓度的苯丙氨酸标准溶液（0，0.5，1， 1.5，2，2.5，3，3.5，4 mmol/L） 各150 μL， 加入3 mL的 OPA试剂，室温下反应2 min，340 nm下测定其吸光度 值。 根据苯丙氨酸不同浓度对应的吸光度绘制标准曲 线。 取10 mL待测的牛奶样品在4 000 r/min下离心 分离20 min，以脱去脂肪。 取脱脂后的牛奶样品 2.5 mL，分别加入5 mL质量分数为12%的三、 0.5 mL蒸馏水，在2 000 r/min下离心15 min。 取清液 150 μL，加入3 mL的OPA试剂，室温下反应2 min， 340 nm下测定其吸光度值。 根据苯丙氨酸标准曲线 计算出牛奶中游离氨态氮的浓度。
1.3.3 甲醛法测定牛奶中蛋白酶活力 采用康小红[9]的方法并进行修改。此方法是通过测 定牛奶中氨基酸态氮的质量浓度来反映蛋白酶的活 力。其原理是利用了氨基酸的两性作用，甲醛能够固定 氨基的碱性，使氨基酸的羧基显示出酸性，通过氢氧化 钠标准溶液滴定来定量，以酸度计测定滴定终点。 具体方法： 取60 mL待测的牛奶样品于200 mL锥 形瓶中，开动磁力搅拌器，用浓度为0.05 mol/L的氢氧 化钠标准溶液进行滴定， 至pH值为8.2时记
下消耗的 氢氧化钠标准溶液的毫升数，此数据可反映出牛奶中的总酸质量浓度。 加入10 mL甲醛溶液后，再用浓度为 0.05 mol/L的氢氧化钠标准溶液继续滴定至pH值为 9.2， 记下此时消耗的氢氧化钠标准溶液的毫升数，以 此计算出牛奶样品中氨基酸态氮的质量浓度。 以水为 空白对照。 牛奶样品中氨基酸态氮的质量浓度按以下 公式计算： X= [(V1-V2)×c×0.014]/V3×100， 式中：X为牛奶样品中氨基酸态氮的质量浓度；V1 为牛奶中加入甲醛后消耗的氢氧化钠标准溶液的体 积；V2为空白组加入甲醛后消耗的氢氧化钠标准溶液 的体积；V3为牛奶样品的取用量；c为氢氧化钠标准溶 液的浓度。
2.4 3种测定方法的比较
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从测定原理来看，福林法、邻苯二甲醛衍生比 法和甲醛法这3种测定蛋白酶活力的方法都是以测定 产物氨基酸的量来表示蛋白酶活力。 但是，福林法是 对蛋白酶分解酪素产生的含有酚基的氨基酸进行测 定，以酪氨酸的量来表示牛奶中氨基酸的量，邻苯二 甲醛比法是通过对与邻苯二甲醛衍生试剂反应的 游离氨基酸进行测定，以苯丙氨酸的量来表示牛奶中 氨基酸的量，甲醛法则是通过消耗碱液的量来测定氨 基酸态氮的质量浓度，以氨基酸态氮的质量浓度来表 示牛奶中氨基酸的量。 3种测定方法和表达方式有所 不同，但福林法
从原理上能够更为实际地反映出牛奶 中蛋白酶的活力。 从检测过程来看，福林法反应条件苛刻，试剂大 多需要现配现用，操作复杂；邻苯二甲醛衍生比法 反应时间最短，操作较甲醛法稍显复杂，测定过程中 温度对SDS溶解性影响较大，SDS的溶解性对吸光度 又有直接影响，因而在测定中对温度的控制增加了操 作的复杂性；甲醛法是3种方法中操作最为简便的，反 应时间适中。 从测定结果来看，福林法精确度和准确度高，3次 重复实验中结果重现性好；邻苯二甲醛衍生比法精 确度和准确度也高，3次重复试验中结果重现性较福 林法较差，这可能是由于测定中环境的温度变化引起 吸光度的差异；甲醛法精确度和准确度均较低，3次重 复试验中结果重现性较差。 将3种方法测定的结果进 行比较分析，其所测得牛奶中蛋白酶活力的表达方式 不同，福林法得到的酶活力单位为u/mL，邻苯二甲醛 法得到的酶活力是以每升牛奶中游离氨基氮的毫摩 数来表示，而甲醛法测得的酶活力是以100 mL牛奶中 氨基酸态氮的克数来表示， 很难直接进行数值比较。 因此，对牛奶样品进行稀释，分别用3种方法测定稀释 后牛奶的蛋白酶活力，结果如表10所示。 运用统计学 的相关分析（t检验：成对双样品均值分析）对三组数据 进行处理，福林法和邻苯二甲醛衍生比法测定结果 的相关系数为0.986，福林法和甲醛法测定结果的相关系数为0.956，邻苯二甲醛衍生比法和甲醛法测定结 果的相关系数为0.983， 表明3种方法的变化趋势是
一 样的， 都可以从不同角度反映出牛奶中蛋白酶的活 力，结果之间可以进行比较客观的比较。
3 结 论
试验对福林法、邻苯二甲醛衍生比法和甲醛法 这3种测定牛奶中蛋白酶活力的方法进行比较， 从相 关性结果来看，3种方法均能从不同角度反映出牛奶 中蛋白酶活力。 福林法虽然操作复杂，但其测定结果 能够直接客观的反应出牛奶中蛋白酶活力， 精确度、 准确度和灵敏度高，重复实验结果的重现性好，适合 于牛奶中蛋白酶活力的精密测定；邻苯二甲醛衍生比 法测定的蛋白酶活力是以1 L牛奶中游离氨态氮的 毫摩数来表示，精确度和准确度好，灵敏度高，反应时 间短， 但测定过程中由温度引起的SDS溶解性问题对 测定结果影响较大，适合于不同样品间蛋白酶活力的 精确比较；甲醛法是以100 mL牛奶中氨基酸态氮的质 量来表征蛋白酶活力的，操作简单，但是准确性和精 确度都较低，重复实验时结果的重现性不好，适合于 粗略性和比较性测定。
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