章银珠;杨广;李冬梅;励丹;翁婉丹
【摘 要】Colorimetric method is a new detection method for the determination of amino acid nitrogen in soy sauce.It has the advantages of simple operation,less sampling volume,and being sensitive, rapid,suitable for batch processing.From the influences of chromogenic agent,color of soy sauce and other factors,discuss the determination of amino acid nitrogen in soy sauce by colorimetric method, and study the recovery rate and precision of the method.And compare with pH meter method ,the experimental results show that the two methods have no significant difference (P>0.05),the result of colorimetric method is satisfactory.%酱油中氨基酸态氮的检测方法,相较于传统的酸度计法,比法作为一种新的检测方法,具有操作简便、灵敏、快速、取样量少、适合批量处理等优点.从显剂、酱油本身泽等因素的影响,探讨了比法测定酱油中氨基酸态氮的注意事项,并研究了该法的回收率和精密度,同时与酸度计法进行比较,结果显示比法与酸度计法两种方法间无显著性差异(P>0.05),比法结果准确.
【期刊名称】《中国调味品》
【年(卷),期】2018(043)006
【总页数】4页(P146-149)
【关键词】酱油;氨基酸态氮;测定;酸度计法;比法
苯酚硫酸法【作 者】章银珠;杨广;李冬梅;励丹;翁婉丹
【作者单位】宁波市食品检验检测研究院,浙江 宁波 315000;宁波市食品检验检测研究院,浙江 宁波 315000;宁波市食品检验检测研究院,浙江 宁波 315000;宁波市食品检验检测研究院,浙江 宁波 315000;宁波市食品检验检测研究院,浙江 宁波 315000
【正文语种】中 文朵康
【中图分类】TS264.21
酿造酱油酱香味浓郁、味道鲜美、泽诱人，是生活中必不可少的调味品。酱油独特的美
味主要是鲜味，Hanifah Nuryani Lioe等指出，酱油的鲜味主要是一些分子量小于500 Da的物质，而游离氨基酸是在钠盐存在下对味觉有重要作用的低分子化合物。另外还有一些肽类物质，尽管其含量极低，但对鲜味却有很大的贡献作用[1,2]。可见，酱油氨基酸态氮的含量对酱油的营养和质量有着至关重要的影响。通常，氨基酸态氮含量越高，酱油品质就越高，鲜味也会越浓。而酱油的国家标准也是根据氨基酸态氮的含量来分级，特级酱油的氨基酸态氮需要大于0.80 g/dL，而最低等级三级的酱油，其氨基酸态氮含量也要不低于0.40 g/dL。因工艺的改进，市售的特级酱油氨基酸态氮含量可以达到1.20 g/dL以上。 传统的氨基酸测定的方法原理是依据其氨基酸两性分子结构，即呈碱性的氨基端或者呈酸性的羧基端。酱油的国家标准GB 18186-2000《酱油》规定，氨基酸态氮含量的检测方法为甲醛值法[3]。该法的原理为定量羧基，即加入甲醛以固定氨基端的碱性，使羧基端显示出酸性，再用氢氧化钠标准滴定溶液定量。该法分析成本较低，测定结果也准确，因此被广泛应用。但是它的缺点是滴定速度较慢，检测过程中仪器设备和试剂等的影响因素也较多。新实行的食品安全国家标准GB 5009.235-2016规定酱油氨基酸态氮的检测方法分别为酸度计法(甲醛值法)和比法[4]。比法的原理为定量氨基端，用硫酸铵为标准物质，用分光光度法显定量。该法操作简便、灵敏、快速、取样量少，适合批量处理，但是该法
目前应用不普遍，尤其在企业中甚少使用。本文探讨了比法应用过程中的注意事项，同时对市售的多种不同等级的酱油的氨基酸态氮含量进行多次测定，结果与酸度计法结果相一致[5-8]。
1 材料与方法
蛋清粉1.1 仪器设备
紫外可见分光光度计：普析通用仪器有限责任公司。
1.2 试剂
纳纱乙酸-乙酸钠缓冲溶液(pH 4.8)、甲醛溶液(36%～38%)、显剂： 37%甲醛15 mL与乙酰丙酮7.8 mL混合，加水稀释定容至100 mL，剧烈振摇混匀；氨氮标准储备液(1.0 mg/mL)：称取0.4720 g 在105 ℃干燥2 h的硫酸铵，加水稀释至100 mL，混匀；氨氮标准使用液(0.1 mg/mL)：移取10 mL氨氮标准储备液于100 mL容量瓶中，用水稀释定容，混匀。所有试剂均为国药集团化学试剂有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 标准曲线的制作
分别移取氨氮标准使用溶液(0.1 mg/mL)0，0.05，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL于10 mL比管中，分别加入乙酸-乙酸钠缓冲溶液4 mL、显剂4 mL，用水稀释至刻度，混匀。然后置沸水浴中加热15 min后取出，冷却至室温。最后以零管为参比调零，用10 mm比皿，于400 nm波长处测量标准曲线溶液的吸光值。以吸光度为纵坐标，氨氮含量为横坐标，绘制标准的曲线，并计算线性回归方程[9，10]。
1.3.2 氨基酸态氮含量的测定
称取试样1.00 g(m)于100 mL(V2)容量瓶中，用水稀释至刻度，混匀。吸取该稀释液0.50 mL(V1)于10 mL比管中，加入乙酸-乙酸钠缓冲溶液4 mL及显剂4 mL，用水稀释至刻度，混匀。然后置沸水浴中加热15 min后取出，冷却至室温。而后以零管为参比，用10 mm比皿，于400 nm波长处测量试样溶液的吸光值。同时进行样品空白试验。试样吸光度扣除样品空白吸光度后，代入线性回归方程，计算试样中氨基酸态氮的含量(m1)。 氨基酸态氮含量(g/100 g)=m1m×1000×1000×V1V2×100。
2 结果
2.1 显剂的放置时间的影响
包头医学院学报分别用现配、放置1天、放置2天、放置3天、放置4天、放置5天的显剂对标准曲线溶液及同一个样品进行显，记录其吸光值，并根据所绘制标准曲线来测定该样品中氨基酸态氮的含量并测定其加标回收率，测定结果见表1。
表1 放置不同时间的显剂对标准曲线单点的测定结果Table 1 Results of the single point of the standard curvedetermined by the color reagent of different time放置时间标准曲线回归方程样品测定结果(g/100 g)加标回收率(加标量40 μg)现配y=0.0113x0.4199放置1天y=0.0113x0.4199放置2天y=0.0108x0.40102放置3天y=0.0106x0.40102放置4天y=0.0100x0.38116放置5天y=0.0082x0.35118
由表1可知，随着显剂放置时间的延长，标准曲线线性明显下降(从0.0113降到0.0082)，测定结果也偏低，导致回收率偏高。而放置3天以后的回收率已经不符合实验室要求。
2.2 样品空白的影响
酱油本身具有较深的酱，市售的酱油通常分为生抽和老抽，生抽主要用来上浅或者佐餐，而老抽颜较深且浓稠，主要用来上。本试验分别抽取生抽和老抽各3种进行样品空白处理：吸取试样稀释液0.5 mL，加入缓冲溶液4 mL，不加显剂，直接用水稀释定容至10 mL，于400 nm处测定吸光值，样品空白吸光值见表2。
表2 样品空白吸光度Table 2 Sample blank absorbance编号生抽1生抽2生抽3老抽4老抽5老抽6样品空白吸光度A-0.063-0.059-0.0650.1050.1660.112
由表2可知，不同种酱油空白值不同，生抽较小，可忽略，而老抽的吸光值较大，测定中必须扣除样品空白。
2.3 冷却方式的影响
试验过程中，加显剂后需在沸水浴中显，若令其自然冷却，结果会出现浑浊现象，将其过膜后比试验吸光值偏低(见表3)，在样品中表现尤为明显，最大的吸光值差为0.132。而沸水浴15 min后若迅速将其冷却，则未出现浑浊，冷却后泽恒定，且未再次出现浑浊。究其原因是自然冷却使其加热时间相对延长，因此沸水浴后需迅速冷却。
表3 冷却方式对吸光度的影响Table 3 Influence of cooling methods on absorbance编号标准点40.0 μg标准点80.0 μg标准点100.0 μg样品1 样品2样品3样品4自然冷却后吸光度A10.4210.8261.0020.5690.6380.6520.995迅速冷却后吸光度A20.4480.8981.1160.6640.7700.7261.102
2.4 标准曲线的绘制
绘制的标准曲线及回归方程，结果见表4。
表4 标准曲线Table 4 Standard curveμg5.010.020.040.060.080.0100.0A0.0540.1140.2350.4480.7020.8981.116y=0.0113x,R2=0.9993
2.5 回收率试验
对比法进行回收率试验，结果见表5。
表5 回收率试验Table 5 Recovery test编号测定值(μg)加标量(μg)加标样测得值(μg)回收率(%)154.04094.5101253.04092.098356.82075.995465.32083.892
2.6 比法测定酱油氨基酸态氮
对市售的5种酱油的氨基酸态氮含量进行测定，并进行平行试验，结果见表6[11]。试验数据精密度较好，绝对标准偏差符合要求(<10%)。
表6 比法测定酱油氨基酸态氮的结果Table 6 Determination of amino acid nitrogen in soy sauce by colorimetry编号平行试验试样质量(m)吸光度A氨基酸态氮含量(g/100 g)平行试验绝对标准偏差(%)111.18460.2740.4121.05870.2450.410211.17270.3640.5521.20150.3800.561.8311.21750.7981.1621.19290.7751.150.9411.15360.3850.5921.2490.4230.601.7511.16970.7861.1921.15010.7741.190
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