目录
摘要..................................................................................................................................... I Abstract ..................................................................................................................................... II 引言 (1)
1.1 研究对象 (5)
1.2 计算方法 (6)
1.2.1 分子动力学模拟 (6)
1.2.2 MD轨迹分析 (7)
1.2.3 MM-GB/SA方法 (7)
九宫算
2 FXa复合物构型分析 (9)
2.1 FXa复合物的RMSD分析 (9)
2.3 水分子数目对FXa复合物结构和结合能的影响 (22) 2.4 小结 (30)
3 FXa复合物的结合自由能 (31)
3.1 结合自由能的计算 (31)
3.2 结合自由能分析 (34)
3.3 FXa复合物的自由能变化与结构的关系 (36)
3.4 小结 (38)赤兔军品
4 氢键分析 (40)
高仙芝结论 (46)
参考文献 (47)
致谢 (52)
引言
凝血因子Xa（coagulation factor Xa, 简称FXa）是一种类似胰岛素的丝氨酸蛋白酶，位于连接内源性和外源性凝血途径共同通路的中心位置，是凝血因子X（coagulation factor X, 简称FX）在凝血过程中的活化产物，也是凝血过程中的关键结合点[1-3]。因此，抑制FXa的活性既能抑制外源性凝血的发生又能阻断内源性凝血。凝血因子Xa的活性位点包含S1、S2、S3和S4四部分。如图1所示，S1是FXa的特异性结合口袋，其包含一个重要的氨基酸ASP189，S2的空间很小，被称为“阴离子洞”，又称Ester binding pocket (EBP)，S3是由ARG143、GLN192等残基组成，S4是由残基PHE174、TYR99和TRP215形成的FXa的芳香性口袋[4-6]。 图1 凝血因子Xa活性位点示意图[7]
Fig. 1 Illustration of the active site of coagulation factor Xa
血液凝固的过程可以通过内源性凝血途径和外源性凝血途径实现。如图2所示，凝血途径的共同通路为得到的FXa在Ca2+和磷脂表面存在的情况下与FVa以1:1的比例形成凝血酶原酶复合物，这一复合物激活凝血酶原，使之转变为凝血酶。生成的凝血酶将血浆中的纤维蛋白原裂解，并且释放出纤维蛋白单体。纤维蛋白单体发生聚合并在FXIIIa 作用下相互交联而最终生成稳定的纤维蛋白凝血块[8]。
图2 凝血途径示意图[9]
Fig. 2 Schematic diagram of coagulation pathway
如果凝血系统发生紊乱，血液中的可溶性纤维蛋白在凝血酶的作用下转化为不溶性的纤维蛋白网架，血小板和红细胞沉积在上面形成血栓。大量血栓的形成会阻碍血液流通，从而导致譬如心肌梗死、深度静脉血栓、肺栓塞等心血管疾病。FXa是凝血“启动途径”和凝血“放大途径”的共同通路的关键位置，使凝血酶原激活为凝血酶。因此，凝血因子Xa是抗凝血药物的重要靶点。
明光市教育局近20年来，血管栓塞性疾病逐渐成为威胁人类健康和生命的主要疾病之一[10-12]。抗凝血药物是目前预防和心血管疾病的主要手段之一[13]。因此，作为抗血栓药物设计重要靶点的凝血因子Xa成为人们研究的热点。到目前为止，凝血因子Xa的相关研究非常之多。在实验方面，杨小蕾等人[14]研究了凝血酶和凝血因子Xa在巨核细胞系Meg-01分化为血小板中的作用及其机制。实验结果表明，凝血酶和FXa在Meg-01细胞的增殖和分化过程中发挥一定作用，在促进Meg-01细胞分化成血小板样颗粒方面具有和促血小板生成素(TPO)相似的作用。何卫东等人[15]研究了蛇伤胶囊对竹叶青蛇伤凝血因子Va、VIIIa、IXa、Xa的影响。研究发现竹叶青蛇毒损伤血管内皮细胞导致凝血因子Va、VIIIa、IXa、Xa水平下降，蛇伤胶囊可以升高血管内皮细胞凝血因子Va、VIIIa、
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IXa、Xa水平，对竹叶青蛇伤引起的凝血障碍有显著作用。在理论方面，Waldner 等人[16]研究影响凝血因子Xa、胰肽酶E、粒酶B三种丝氨酸蛋白酶局部和整体特异性的关键因素，并且尝试寻构象结合焓与丝氨酸蛋白酶底物特异性的定量相关。他们发现由具有代表性的团簇构象确定的加权平均值的局部相互作用势与FXa和胰肽酶E的底物特异性相关性很高，但其与粒酶B的相关性则很低。Austin D. V ogt等人[17]通过使用动力学方法证明在快速动力学阶段Na+与凝血酶和凝血因子Xa的结合服从E-E*平衡，并且表明E-E*平衡是胰蛋白酶折叠的一般特征。
在生物大分子体系中，水分子影响着蛋白结构、功能以及蛋白与配体的结合模式[18-20]。在蛋白与配体的结合过程中，水分子的重要性越来越受到人们的关注[21]。最近有些课题组在分子对接[22-23]以及药物分子设计[24-27]中将水分子考虑进来，得到了更加精确的数据。徐维维等人[28]在蛋白-配体对接过程中引入显性水分子，将水分子空间占据和氢键相互作用对复合物对接结构的影响考虑进去，提出了一种包含水分子的蛋白-配体对接算法，结果表明引入水分子使蛋白-配体对接效率有明显提高。Bottoms等人[29]提出一种半自动计算方法用于识别蛋白结构中的水分子位点，并将该方法成功地应用
于包含丝氨酸蛋白酶在内的六种蛋白质家族。结果表明蛋白质结构中被保留的水分子是识别这些蛋白质家族三维结构的重要特征之一。Woods等人[30]采用QM/MM方法计算了包含水分子的神经氨酸苷酶蛋白-配体复合物的结合自由能，并证实处于亲水环境的水分子与神经氨酸苷酶蛋白的结合能力更强。Zhu等人[31]对MM-PB/SA方法进行了修正，发展了一种water-MM-PB/SA方法，并将该方法应用于JNK3抑制剂、抗生物素蛋白和神经氨酸苷酶抑制剂三大体系。研究表明将接近配体和蛋白的显性水分子作为蛋白质结构的一部分可以改善结合自由能的预测值与实验值的相关性。同时他们发现由水分子引起的极性相互作用对结合自由能有着至关重要的影响。
相比之下，到目前为止已报道的相关研究中很少有对包含水分子的凝血因子Xa的研究。Wallnoefer等人[32]采用分子动力学模拟研究FXa复合物。其FXa复合物结构分别取自PDB数据库和BI数据库。作者对比分析两个结构的RMSD和B-factors以及不同位点的水分子对FXa结构的影响。研究结果表明，对蛋白质周围水分子的数据进行彻底分析是非常重要的。Nguyen等人[33]首次将基于网格的水合分析(GIST)应用于FXa蛋白-配体复合物，并与基于水合位点方法(HSA)进行比较。结果表明，当采用完全相同的模拟数据时，基于GIST的配体评分函数要优于基于HSA的评分函数。但是这些报道都侧重于研究FXa中水分子的各种性质，并没有对FXa的结构进行深入系统的研究。水分子的存在是否会对FXa的结构及功能造成影响，会造成怎样的影响，这些问题的研究对于以FXa为靶标的药物设计有着十分重要的意义。因此，我们以包含水分子和不包含水
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分子的FXa蛋白-配体复合物为研究对象，使用分子动力学模拟方法，研究水分子对FXa 蛋白-配体复合物结构和结合自由能的影响。
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