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过了十多年的摸索和发展，miRNA功能研究已经形成了基本的实验路线，通过寻研究对象、确认研究对象、寻靶关系、确认靶关系和确认生物学功能的五大步骤，单纯研究一个miRNA的下游功能是非常简单的，也发表了非常多的成果。现如今，人们对于miRNA上游的关注度越来越高。我们知道了很多miRNA调控什么，但是什么调控miRNA呢？对于miRNA上游调控因子的研究还比较少，甚至很多十几年前就已经发现的组织特异性miRNA，现如今仍无法解释其特异性的决定因素。因此，研究miRNA上游不但具有重要的生物学意义，发表文章的层次也会比较高。那么，进行miRNA上游研究，都需要进行哪些实验步骤呢？ miRNA上游研究的常规思路
不饱和树脂∙寻一个miRNA作为研究对象。
∙预测该miRNA的启动子位置。常用的工具有如DIANA-miRGen v3.0、PROmiRNA、Promoter 2.0 Prediction、Promoter Scan等。或者利用DNA甲基化的情况预测启动子位置。 ∙通过双萤光素酶等实验验证启动子。
∙通过在线工具预测启动子附近的转录因子结合情况或甲基化的情况，预测影响miRNA转录的因子。常用的预测网站如TRANSFAC、Mapper、TRED、Consite等。
∙通过pulldown/质谱/凝胶阻滞/Co-IP等方法确认该因子确实能与启动子结合。
∙通过双萤光素酶检测/突变及敲除等方法确认这些因子确实能对miRNA的表达产生影响。
∙绉完成miRNA的下游靶点相关实验，证明这种对miRNA的调控具有何种生物学作用。
以上是miRNA上游研究的常规思路，从miRNA入手，预测和验证它的上游调控因子，然后检测这些调控因子能通过调控miRNA发挥怎样的功能。但是，从上述的实验过程我们可以看到，预测占据了较大的比重，预测的准确率直接决定了实验的速度和成本。那么是否有更简单的上游研究方法呢？我们不妨试试如下的方法，把上游研究转变为下游研究，实验会更加方便。
miRNA上游研究的转换思路
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∙寻这个蛋白在发挥功能时，哪些miRNA产生了变化。如，过表达某蛋白前后，用高通量的方法检测哪些miRNA表达量产生了变化。
∙许昌学院学报预测和验证该miRNA的启动子。
∙通过pulldown/质谱/凝胶阻滞/Co-IP等方法确认目的蛋白确实能与启动子结合。
董鸡∙通过双萤光素酶检测/突变及敲除等方法确认这些因子确实能对miRNA的表达产生影响。
∙完成miRNA的下游靶点相关实验，证明这种对miRNA的调控具有何种生物学作用。
我们看到，这个思路的后四步在之前的思路中都有涉及，但前两步与之前不同，最大不同就是以蛋白作为切入点。我们的是蛋白下游的miRNA，而不是miRNA上游的蛋白，但是同样达到了研究miRNA上游的目的。虽然这个思路仍需预测miRNA启动子，但不再需要进行启动子结合蛋白的预测，只需进行验证即可，大大提高了实验成功率。
图1. miRNA上游研究基本流程举例。A，寻研究对象。诱导Follicular helper T cells（Tfh）分化和成熟，通过高通量测序，到分化前和分化后表达量显著降低的miR-31，并用qPCR的方法验证。B，预测miRNA启动子。通过甲基化位点分析，预测miR-31的启动子，在miR-31的启动子上同时预测到一个BCL6的结合位点。C，验证miRNA启动子和蛋白的关系。通过凝胶阻滞实验证明BCL6确实能与miR-31启动子相互作用，通过双萤光素酶实验证明BCL6确实能够通过该启动子调控下游基因的表达，通过体内实验证明过表达BCL6确实能够降低体内miR-31的表达量。D，完成miR-31下游靶基因和功能实验，证明B
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CL6抑制miR-31之后引发相应的生物学功能（Ripamonti et al., PNAS, 114(48):12797-12802(2017).）。
总之，对于miRNA的上游我们还知之甚少，还有很大的发展空间。除了蛋白之外，其他非编码RNA如lncRNA、circRNA等近些年都有报道可以调控miRNA的表达和作用，这些因子也同样是miRNA的上游因子，具有很大的研究潜力。
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