食品与药品Food and Drug2021年第23卷第1期85
张言慧「，高先岭「，黄魁2，郭青青「，袁建国2*
(1.山东国力生物科技有限公司，山东济南250014；2.山东国力生物技术研究院，山东济南250101)
摘要：作为应用最为普遍的蛋白质表达系统，重组大肠杆菌表达系统具有其他表达系统无法比拟的优越性。本文综述了大肠杆菌作为表达系统的特征，釆用重组大肠杆菌表达的重组蛋白及生物化学产品概况，概述了表达载体中营养源诱导启动子、温敏型启动子及乳糖启动子3种不同类型启动子特点。另外分析了不同大肠杆菌宿主对碳源的代谢特征，乙酸代谢对大肠杆菌生长及重组蛋白表达的影响，丙酮酸代谢及乙醛酸循环的特征，最后介绍了发酵过程调控对重组大肠杆菌表达系统的影响。 关键词：大肠杆菌；发酵；代谢；启动子；重组蛋白yrz
中图分类号：Q939.97文献标识码：A文章编号：1672-979X(2021)01-0085-07
DOI：10.3969/j.issn.l672-979X.2021.01.018
Research Progress on Fermentation Expression and Metabolism Regulation of Recombinant
Escherichia Coli
ZHANG Yan-hui1,GAO Xian-ling1,HUANG Kui2,GUO Qing-qing1,YUAN Jian-guo2
收稿日期：2020-10-29
基金项目：山东省重大科技创新工程项目(2019JZZY010520)
作者简介：张言慧，硕士，工程师，研究方向为微生物发酵过程优化
"通讯作者：袁建国，研究员，研究方向为食品与药品生物技术E-mail:******************
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姜山实验中学
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86食品与药品Food and Drug2021年第23卷第1期
(1.Shandong Guoli Biotechnology Limited Company,Jinan250014,China；2.Shandong Guoli Biotechnology
Research Institute,Jinan250101,China)
Abstract:As the most widely used protein expression system,the recombinant Escherichia coli expression system has more advantages than other expression systems.In this paper,the characteristics of Escherichia coli as an expression system were reviewed,and recombinant proteins and biochemical products expressed in recombinant Escherichia coli were introduced.The characteristics of three different types of promoters including nutrition-induced promoters, temperature-sensitive promoters and lactose promoters in expression vectors were summarized.In addition,the metabolic characteristics of carbon sources in different Escherichia coli hosts,the eflect of acetic acid metabolism on the growth of Escherichia coli and expression of recombinant protein,the characteristics of pyruvate metabolism and glyoxylic acid cycle were analyzed.Finally,the effect of fermentation regulation on the expression system of recombinant Escherichia coli was introduced.
药用植物学论文Key Words:Escherichia coli;fermentation;metabolism;promoter;recombinant protein
由于大肠杆菌遗传学背景较清楚，生长速度快，培养基条件要求较低，容易实现高密度培养等特点，长期以来是商业生产重要目的基因的表达系统为了获得高水平的基因表达产物，综合考虑控制转录、
翻译、蛋白质稳定性及向胞外分泌等多方面因素，设计了许多具有不同特点的表达载体，以满足表达不同性质、不同要求的目的蛋白需要冈。此外，宿主系统本身的特性也是重要的研究对象叫
大肠杆菌BL21(DE3)及其衍生菌株是目前重组蛋白表达使用最广泛的菌株冏。与其他革兰阴性菌一样，大肠杆菌有细胞内膜与细胞外膜之分，并将细胞分成两部分空间：细胞质与细胞周质，通常重组大肠杆菌表达的重组蛋白存在于细胞质。细胞质内可溶性重组蛋白易受大肠杆菌内源性蛋白酶降解，导致表达水平低下。形成包涵体的重组蛋白可有效避免内源性蛋白酶的降解，且分离纯化方便，分离效率高，但重组蛋白的复性较困难。当含有二硫键的重组蛋白正确折叠成空间构象的时候，需利用某些信号肽和前肽序列，将重组蛋白分泌至细胞周质或细胞外的培养液中冏。这不但有利于重组蛋白的分离纯化，也能减少内源性蛋白酶降解，周质 分泌可获得具有天然一级结构的产物。同时氧化性的周质间隙可模拟真核细胞的内质网环境，便于新生肽链折叠成天然结构，从而获得具有完全生物学活性的重组蛋白。但是，由于周质空间容量有限，及重组蛋白的不完全跨膜转运，使周质分泌表达的重组蛋白表达量低，表达量稍高时容易形成包涵体，并易发生二硫键错配，而分泌到胞外可很好地解决这些问题叫 1重组大肠杆菌相关产品
由于生物药有高活性、高特异性和低毒性等特点，市场发展前景广阔。2015-2019年中国生物药市场
规模从1453亿元增长至3172亿元，预计2020年我国生物药市场规模将达到3870亿元。利用重组大肠杆菌可生产多种蛋白质/多肽类生物药，这些生物药被广泛用于临床多种疾病，表1列举了近年以大肠杆菌作为表达宿主生产的蛋白质药物。
借助基因编辑技术，通过基因敲除，质粒导入等手段改变大肠杆菌的代谢途径，可生产大量的生物化学产品。表2列出了由大肠杆菌生产的一些生物化学产品。
2重组大肠杆菌表达载体的特点
目前普遍使用的表达质粒是多个复制子、启动子、选择性标记、多克隆位点及融合蛋白移除策略组合的结果冋。在产业化中，大肠杆菌宿主菌应用较成熟的有：BL21系列、JM109系列、W3110系列和K802系列等，常用的启动子有Pg、Ppm、P l、P r、P t P血等，质粒如pET、pBV220、pRKl、pRLK14等。不同宿主菌与质粒往往有一定的选择匹配性。大肠杆菌生产重组蛋白常用的启动子见表3。
食品与药品Food and Drug2021年第23卷第1期87表1大肠杆菌作为表达宿主生产的生物药物m
英文名称产品临床作用
Humulin重组人胰岛素糖尿病
Filgrastim,G-CSF人粒细胞集落刺激因子中性粒细胞减少症Intron A a2b型干扰素癌症、肝炎
Ontak地尼白介素皮肤T细胞淋巴瘤Insulin Glargine甘精胰岛素糖尿病Anakinra阿那白滞素类风湿性关节炎
Rapilysin瑞替普酶急性心肌梗死
Ranibizumab兰尼单抗湿性年龄相关性黄斑变性
Somatropin促生长激素生长激素缺乏症；Turner综合症Certolizumab pegol聚乙二醇赛妥珠单抗克罗恩病
PEG interferon alfa-2b聚乙二醇干扰素a2b慢性丙型肝炎感染Romiplostim重组人血小板生成素拟肽慢性免疫性血小板减少性紫瘢Interferon beta lb干扰素Plb多发性硬化症Pegloticase聚乙二醇尿酸特异性酶慢性痛风症Preos甲状旁腺激素骨质疏松症、甲状旁腺功能减退症Caplacizumab卡普赛珠单抗获得性血栓性血小板减少性紫瘢
表2大肠杆菌生产的生物化学产品m珂
化学品作用Escherichia coli菌株牡丹皮葡萄糖昔抗氧化剂，食品着剂BL21Star(DE3)翠菊昔抗氧化剂，食品着剂rpoA14(DE3)(K12衍生)
苯甲醇溶剂ATCC31884b
戊二烯药物组成BL21(DE3)
香草醛风味添加剂MG1655(DE3)
下地岛肉桂醛风味添加剂W3110醋酸异丁酯风味添加剂BW25113衍生
乙酸，丙酸和丁酸酯风味添加剂BW25113衍生醋酸苯乙酯风味添加剂MG1655
柠檬烯风味添加剂；生物燃料DH1
石竹烯风味添加剂；生物燃料DH1
芳樟醇风味添加剂；生物燃料DH1衍生
酪醇药物前体BW25113(DE3)衍生
苯乳酸抗菌素BW25113(DE3)衍生
紫杆菌素抗生素，抗癌BL21Star
富马酸化学原料W3110衍生
己二烯二酸化学原料BW25113衍生
芹菜素功能食物BL21Star
芫花素功能食物BL21Star
丁醇生物燃料BW25113衍生紫穗槐二烯药物DH1
88食品与药品Food and Drug2021年第23卷第1期
表3大肠杆菌生产蛋白药物通常所用的启动子哙均
启动子诱导方式关键特征Phage九PR,P L改变温度高水平表达；严禁控制Lac IPTG相对低水平表达
郭仕伟Tac,trc IPTG高水平表达T7IPTG非常高的水平表达
PhoA耗尽磷酸高水平表达，严禁控制，培养基限制
Plux高丝氨酸内酯高水平表达；严禁控制；廉价的诱导剂
目前，重组大肠杆菌的工业化发酵主要采用营养源诱导、温度诱导、IPTG（丙基硫代半乳糖昔, isopropyl#-D-thiogalactoside）和乳糖诱导3种方式，现分别概述如下。
2.1营养源诱导
营养源诱导启动子包括pho A、ugp、mgl及ara B等，此种表达方式受培养基中的营养物质无机磷浓度（Pi）、糖原或生物素调控，其调控机制类似于血。表达系统问。其他尚有pH及溶氧诱导调控型，虽然其中一些表达系统的应用例子还不多，但已显示出很好的发展潜力。
国企再掀反腐风暴
2.2温敏性启动子诱导
温敏性启动子有P l、P r或其杂合启动子P l P r 等。发酵培养温度采用温度传感器检测并闭环控制。对于采用温敏型启动子的大肠杆菌重组菌，温度检测与控制十分关键。在发酵过程中温度陡然升高，使细胞内的酶活性加强，代谢加快，但当温度持续较高时，会引起细胞内一些酶活性降低或变性，细胞活力逐渐减弱，甚至死亡，即产生细胞内结构性变化。因此采用温敏型启动子菌株表达外源蛋白，诱导时间较短，适用于培养规模较小的重组蛋白发酵。
温度控制策略通常以30°C或37°C开始培养大肠杆菌到所需的细胞密度，再升温至42°C进行诱导培养。对于温敏型表达系统，最佳的发酵过程控制方法是在42°C高温诱导培养1h后，采用温度逐渐下降的变温策略，诱导时间可明显延长，表达水平明显提高盟。
2.3IPTG及乳糖诱导
采用IPTG诱导发酵的重组菌，IPTG浓度应控
制在亚适量水平，浓度过高导致细胞中毒，浓度过低引起启动子启动程度减弱，从而影响外源蛋白高效表达。另外IPTG存在于发酵液中时，对重组蛋白纯化亦带来一定难度。
产业化规模应用的大肠杆菌表达系统菌株绝大多数为IPTG诱导型，常用的启动子有Pg。和P血等。当大规模生产时，IPTG的使用成本也是重组蛋白产业化主要原材料成本之一，因而发展了用乳糖替代IPTGW导的发酵工艺。由于IPTG对细胞生长有一定的抑制作用，在使用时浓度一般只需诱导启动子（P如或P»c）启动则足够，启动子过度启动并不能达到高效表达外源蛋白的目的。Silaban等问研究认为当IPTG浓度增大时，将使细胞生长速率下降，导致细胞生长的稳定期提前到来，甚至加速细胞死亡。Luciana等㈣认为用IPTG诱导细胞表达重组蛋白将改变细胞生长过程和细胞的能量库。
由于IPTG对细胞有一定的毒害作用、大规模发酵价格昂贵和蛋白质药物纯化操作难度增加等原因，在实际大规模发酵时，一般均采用乳糖替代iptg[21].乳糖与其他碳源比例是关键因素，乳糖浓度过小，由于甘油等碳源对启动子产生阻遏作用或抑制作用，使启动子不能启动或启动强度不够，易造成不表达或低水平表达；而乳糖浓度过大，会使得菌体只利用乳糖，造成碳源浪费，一般乳糖浓度约为2g/L。
3重组大肠杆菌的代谢特性
3.1不同大肠杆菌宿主对碳源的代谢特征
作为培养基中最广泛采用的碳源，葡萄糖和甘油在一定水平上影响大肠杆菌的生理特性凶（见图1）。葡萄糖通过磷酸葡萄糖转移酶系统（PTS）
食品与药品Food and Drug2021年第23卷第1期89
途径进入细胞内，与此同时磷酸烯醇式丙酮酸转化为丙酮酸卿。大肠杆菌通过3个途径分解葡萄糖转变为丙糖，包括糖酵解途径、ED途径和PP途径删。大肠杆菌BL21和大肠杆菌JM109两种菌株利用葡萄糖做碳源时，当碳源代谢流经过丙酮酸时，若超过了三竣酸循环处理能力即产生乙酸，其聚集有培养基和菌株特异性〔却。大肠杆菌BL21作为宿主细胞表达重组蛋白有优势，JM109产生的乙酸浓度高于BL21，且当细胞密度增加时两个菌株的乙酸聚集速率均降低时。甘油在甘油脱氢酶（GDH）和二径丙酮激酶（DHAK）的催化下转变为二径丙酮磷酸进入糖酵解途径旳。在利用甘油作为碳源转化为磷酸烯醇式丙酮酸或丙酮酸时，产生的氧化还原当量是葡萄糖的两倍。甘油转化为琥珀酸或乙醇是氧化还原平衡过程。
图1大肠杆菌耗氧发酵条件下中心代谢途径图
3.2乙酸与比生长速率对发酵的影响
大肠杆菌发酵过程中易产生副产物乙酸，发酵液中乙酸浓度过高将抑制细胞生长和重组蛋白生产率跑，来自于中心代谢途径的产物将与乙酸生成途径相竞争。在指数生长期乙酸激酶（ackA）是生成乙酸的主要途径，在稳定期丙酮酸氧化酶（poxB）途径占据优势删（见图1）。由于在诱导前和诱导后不同菌体比生长速率卩值对细胞生长和蛋白表达有协同影响，可在诱导前无乙酸抑制条件下进行补料分批实验，从而避免乙酸对细胞生长和重组蛋白生产的抑制。Valiollah等削研究了4种不同补料分批模式中细胞生长和重组蛋白表达的变化特征，得出结论：生物质对底物的得率受卩的影响；由于外源蛋白过量表达，生物质的生产率受诱导后卩的高度影响。
提高重组大肠杆菌的发酵水平可从两个方面入手，即提高菌体密度和单位菌体生产的外源基因产物。通过补料分批发酵可实现大肠杆菌的高密度培养。大肠杆菌高密度细胞发酵条件下的乙酸代谢，低pH培养条件下低于高pH培养条件下的乙酸浓度。在低葡萄糖浓度条件下，当葡萄糖消耗速率下降时，乙酸开始被利用，且异柠檬酸裂解酶（aceA）的活性增加的。另外，质粒的稳定性是影响大肠杆菌补料分批培养过程中重组蛋白生产的另一个重要的因素。研究结果表明：发酵过程中以较卩进
外源基因的表达水平。
3.3丙酮酸及乙醛酸循环的代谢特征
大肠杆菌中存在磷酸烯醇式丙酮酸竣基酶（^pckS^因编码）和磷酸烯醇式丙酮酸竣化酶（由ppc基因编码），二者是由多拷贝质粒上的tac启动子控制的。这两个酶同时过表达，会激发氧气和葡萄糖的消耗，并降低生长得率，导致丙酮酸和乙酸大量分泌。消除这种效应可通过敲除质粒上的pck 或者ppc基
丙酮酸转化为乙酰辅酶A是通过丙酮酸甲酸裂解酶（PFL）的作用列（见图1）。
乙醛酸循环主要的控制点是异柠檬酸脱氢酶（IDH）的激活和去激活。当大肠杆菌利用乙酸作为碳源时，约75%IDH处于去激活状态，可导致异柠檬酸浓度增加，从而使异柠檬酸裂解酶发挥作用丽。另外，当TCA循环通量低并有乙酸存在
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