收稿日期：2018-11-06
基金项目：云南省教育厅科学研究基金（2014Y411）作者简介：冷静（1975～）女，副主任医师，从事呼吸感染疾病，慢性咳嗽，，肺血栓栓塞研究20余年。通信作者：奎翔Email ：kuixing@foxmail 肺血栓栓塞症（Pulmonary thromboembolism ，PTE ）是遗传、环境及行为等多种危险因素共同作用的全身性疾病。国外三项涉及5500例内科疾病患者的大型临床研究表明，在没有预防的情况下，有11%～15%的患者发生PTE [1-3]。我国的流行病学资料显示，老年内科住院患者PTE 的患病率为9.7％[4]，为PTE 高危人。在肺栓塞PTE 的住院病人中，年龄超过50岁的病人高达70.3%。从1996年-2008年，我国住院病人PTE 发生率一直呈上升趋势[5,6]。蛋白S （proteinS ，PS ）是一种维生素K 依赖性酶原，PS 、蛋白C 、蛋白C 抑制物和血栓调节蛋
白共同组成机体内重要的抗凝系统，在血液凝固和纤溶过程起着重要的平衡作用。蛋白S 基因启动子区甲基化，有着千丝万缕的关系，现将我院2014年7月-2017年4月收治并确诊的20例“不明原因”PTE 患者与蛋白S 基因启动子区甲基化的关系报告如下。 资料与方法
一、一般资料
选用我院于2014年7月-2017
年4月收治并确诊的肺血栓栓塞症患者进行前瞻性研究分析，选取20例“不明原因”肺血栓栓
塞症
To show the relationship between gene methylation of anticoagulation factor and pul-monary thromboembolism by analyzing the promoter methylation level and plasma concentration of anticoagulant fac-tor PS,PC and
AT.
To detect the promoter methylation level of anticoagulation factor between pulmonary
thromboembolism group and control group by pyrosequencing.Further,ELISA was used to detect the difference of plasma concentration of anticoagulant factor between hypermethylation samples and control
察哈尔
煤矸石砖group.
Com-pared with the normal control group,the methylation rate of PS gene promoter in the pulmonary thromboembolism group increased significantly (<0.001),and the plasma PS concentration in hypermethylation samples was signifi-cantly lower than that in the control group (=0.0051).The increase of methylation level in the promoter
region of PS gene leads to the decrease of plasma concentration of PS,which promotes the formation of pulmonarycielab
thrombosis.国际能源机构
Protein S ；Promoter ；Methylation ；Pulmonary thromboembolism
·论著·
蛋白S 基因启动子区甲基化与蛋白S 血浆浓度及肺血栓关系研究 冷静1，奎
翔2，李海峰1
（1．云南省第三人民医院
呼吸科，云南
昆明
650011；2．昆明医科大学第二附属医院
病理科，云南
昆明
650101）
摘要：目的分析抗凝因子PS 、PC 和AT 基因启动子区甲基化水平及其血浆中的浓度，阐明抗凝因子基因甲基化与肺
血栓栓塞症之间的关系。方法
焦磷酸测序法检测肺血栓栓塞症组和对照组之间抗凝因子甲基化水平差异；进一步使用 ELISA 检测高甲基化样本和对照组抗凝因子血浆浓度差异。结果与正常对照组相比，肺血栓栓塞症组中PS 基因启动子区
甲基化率明显升高（＜0.001）；高甲基化样本的PS 血浆浓度较对照组明显降低（＝0.0051）。结论
PS 因子启动子区甲基
化水平升高，导致PS 血浆浓度降低，进而促进肺血栓的形成。
碳酸氢钠溶液关键词：蛋白S ；基因启动子区；甲基化；肺栓塞中图分类号：R563.5
文献标志码：A
文章编号：1006-4141（2019）03-0193-03
患者为PTE组，同时随机选取同期在我院体检科体检的人员为对照组。对比PTE组与对照组PS血浆浓度及启动子区甲基化之间的关系。PTE及对照组各20例。其中，PTE组有14例为男性，6例为女性，年龄范围在60～82岁，平均年龄为（69.2±4.2）岁；对照组均为健康体检者，13例为男性，7例为女性，年龄范围在56～78岁，平均年龄为（67.3±4.6）岁。
二、诊断标准肺血栓栓塞症诊断标准，符合以下一项即可诊断[4]：⑴核素肺通气/灌注扫描：其征象为至少一个或更多叶段的局部灌注缺损而该部位通气良好或X线胸片无异常；并伴或不伴有呼吸困难、气促、胸痛、晕厥、烦躁不安、惊恐、咯血、咳嗽、心悸等肺血栓栓塞症临床表现；⑵CT肺血管造影（CTPA）：肺动脉内的低密度充盈缺损，部分或完全包围在不透光的血流之间（轨道征），或者呈完全充盈缺损，远端血管不显影；并伴或不伴有呼吸困难、气促、胸痛、晕厥、烦躁不安、惊恐、咯血、咳嗽、心悸等肺血栓栓塞症临床表现；⑶核磁共振成像（MRI）发现深静脉血栓，或者呈完全充盈缺损，远端血管不显影；并伴或不伴有呼吸困难、气促、胸痛、晕厥、烦躁不安、惊恐、咯血、咳嗽、心悸等肺血栓栓塞症临床表现；⑷肺动脉造影：有肺血管内造影剂充盈缺损，伴或不伴轨道征的血流阻断；并伴或不伴有呼吸困难、气促、胸痛、晕厥、烦躁不安、惊恐、咯血、咳嗽、心悸等肺血栓栓塞症临床表现。
三、入选标准PTE组入选标准：年龄≥60岁，符合上述PTE诊断标准，并排外50岁以前有反复血栓病史，有易栓症家族史。所有病例行AT、PC，PS缺陷和FV Leiden的表型（功能活性）测定，以排外遗传性易栓症[4]。排外各种获得性因素，如：创伤、手术、中心静脉置管、妊娠、卧床超过3d等。排除服用抗凝药物、维生素补充剂和其他影响甲基化状态的药物如叶酸、维生素B12等[5,6]。甲基化及健康对照组以我院体检中心健康体检人为对象。每例病例保存详细病历资料，详细记录血栓部位、栓子数量、栓子体积、各种临床生化指标及出凝血指标。
四、样本采集与处理⑴外周血采集：入选对象于入院或体检当天用EDTA抗凝管采集外周静脉血4mL。2mL分离血浆，2mL立即冻于-80℃备用。⑵2mL外周血分离血浆：4℃静置30min，4℃2000rpm离心10min，收集上层血浆冻于-80℃备用。⑶全血基因组DNA提取：全血基因组DNA提取参照QIAamp DNA Mini Kit试剂盒说明书进行。
五、PS启动子区甲基化率检测⑴基因组DNA重亚硫酸盐处理：使用EpitectBisulfite试剂盒对样本基因组DNA进行重亚硫酸盐处理，处理步骤按说明书进行。⑵以亚硫酸盐处理后DNA为模版，PCR扩增PS，PC和AT基因启动子区CpG密集区。PCR反应条件如下：95℃5min；95℃30s，59℃30s，72℃30s，重复以上3步35个循环；72℃下延伸8min。在PSQ HS96A焦磷酸测序平台上，使用测序引物“S”完成焦磷酸测序。焦磷酸测序分析PS上游启动子区4个CpG二核苷酸位点上胞嘧啶甲基化水平。
六、PS，PC和AT血浆浓度测定使用ELISA 试剂盒，操作步骤按说明书进行。
七、统计学分析统计数据采用Prism5.0软件分析。组间比较采用检验，计量数据采用均数±标准差（x軃±）表示，分析评估PS基因启动子区甲基化与血浆PS浓度之间的关系，＜0.05时认为差异有统计学意义。
结果
一、PS，PC和AT基因启动子区甲基化结果：对照组PS基因启动子区甲基化率30.95%，PTE组PS 基因启动子区甲基化率55.32%，PTE组较正常对照组PS基因启动子区甲基化率显著增高（＜0.001）；对照组PC基因启动子区甲基化率98.31%，PTE组PC基因启动子区甲基化率97.84%；对照组AT基因启动子区甲基化率94.59%，PTE组AT基因启动子区甲基化率94.36%；PC和AT基因启动子区甲基化水平在正常组和对照组之间（＞0.05）无明显差异，见表1、图1。
二、PS、PC和AT血浆浓度结果：PS因子血浆浓度对照组为（23.35±2.73）mg/L，PTE组为（15.76±4.62）mg/L，PTE组PS因子的血浆浓度较正常对照组明显减低（=0.0051）；PC因子血浆浓度对照组为（3.85±0.46）mg/L，PTE组为（3.92±0.51）mg/L；AT因子血浆浓度对照组为（0.21±0.04）mg/mL，PTE组为（0.20±0.05）mg/mL；PC 和AT因子的血浆浓度，PTE组和对照组（＞0.05）无明显差别，见表2、图2。
讨论
目前研究表明，衰老导致肿瘤、COPD等老年
相关疾病的原因主要是表观遗传调控的结果。随着衰老的发生，基因组范围的表观遗传特性也发生改变。作为主要表观遗传学调控手段的DNA 甲基化在基因表达调控中发挥关键作用。研究表明，基因非编码区，尤其是启动子区的甲基化水平改变，导致了基因表达水平的变化，进而使组织更新减慢，机
体抗病能力降低，肿瘤发生率增高[4]
。
而肿瘤是PTE 的独立危险因素[4]。最新研究表明，外周血单核细胞中凝血因子Ⅶ（F Ⅶ）启动子的甲基化水平与血浆F Ⅶ活性呈负相关，F Ⅶ启动子的低甲基化水平，增加了冠心病的风险[5]。该研究揭示了凝血因子活性受其编码基因启动子区甲基化水平的影响。本研究以老年“原因不明”PTE 患者为研究对象，与正常人做对比，分析各抗凝因子（PC 、PS 及AT Ⅲ）浓度与其启动子区甲基化水平的关系。发现PS 基因启动子区的甲基化水平在PTE 组中明显高于正常对照组，其血浆PS 浓度明显
降低。由此我们可以得出PS 基因启动子区的甲基化通过影响PS 血浆浓度，参与了PTE 的形成。重视PS 甲基化率的测定可以预测PTE 发生的可能性，为临床诊疗提供新的诊疗手段。
［参考文献］
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表1PS ，PC 和AT 基因启动子区甲基化结果
表2
PS 、PC 和AT 血浆浓度结果PS 基因甲
基化率
（%）对照组30.95值＜0.001
PC 基因甲
基化率（%）98.31＞0.05
AT 基因甲
基化率（%）94.59＞0.05
PTE 组55.3297.8494.36PS 血浆浓度
（mg/L ）
对照组23.35±2.73值
0.0051
PC 血浆浓度
（mg/L ）3.85±0.46＞0.05
AT 血浆浓度
（mg/mL ）0.21±0.04＞0.05
PTE 组15.76±4.62 3.92±0.510.20±0.05图2
图
1
PTE （甲基化
）脚印中国
血清抗凝因子浓度
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