918细胞与分子免疫学杂志（Chin J Cell M ol ImmU n〇l)2020, 36(10) .论著•文章编号：1007 -8738(2020)10 -0918 -06 含表皮生长因子受体（E G FR)启动子萤光素酶报告基因的三阴性乳腺癌 细胞模型的建立 梁丹丹、王春苗\李俊莹、覃良淑\粟正英2，侯华新|+
G广西医科大学药物分析教研室，广西南宁530021; 2广西国际壮医医院药学部，广西南宁530201) [摘要]目的建立稳定表达人表皮生长因子受体（EGFR)启动子及萤光素酶（Luc)报告基因的三阴性乳腺癌细胞系，并对其 应用进行初步验证。方法采用基因重组技术，构建含有EGFR启动子以及Luc报告基因的慢病毒载体，并感染MDA-M B231 细胞，经过嘌呤霉素筛选获得能稳定表达Luc活性的MDA-M B231-EGFR-Luc2细胞系；分别采用EGFR激活剂EG F以及抑制剂 吉非替尼处理细胞后检测Luc活性变化。结果通过基因测序和质粒双酶切鉴定，EGFR基因启动子Luc报告基因-慢病毒表 达载体构建成功，经过嘌呤霉素筛选获得稳定表达Luc的MDA-MB231-EGFR-LU C2细胞；EGF可剂量依赖性的增加细胞中Luc 的活性，而吉非替尼则相反。结论建立了MDA-M B231-EGFR-Luc2稳定表达EGFR启动子及Luc报告基因细胞系，为高通量 筛选靶向EGFR的抗肿瘤药物提供一类新的细胞模型。 [关键词]表皮生长因子受体；启动子；萤光素酶报告基因；三阴性乳腺癌；MDA-MB231细胞
[中图分类号]Q279, R737.9, R392-33, R965 [文献标志码]A
表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor,E G F R)为跨膜酪氨酸激酶蛋白，是酪氨酸 激酶受体超家族的成员之一。E G F R调控的信号通 路在细胞增殖、存活、分化、迁移中发挥着关键作 用[1_3]，E G F R在肺癌、卵巢癌、鼻咽癌、乳腺癌等 多种恶性肿瘤中均呈高表达且与患者的预后不良密 切相关[4_6]。三阴性乳腺癌（triple negative breast cancer，T N B C)是浸润性最强的一类乳腺癌的亚型，不表达雌激素受体（estrogen receptor,E R)、孕激素 受体（progesterone receptor,P R)和人表皮生长因子受 体 2 (human epidermal growth factor receptor2, HER2 )[7]。T N B C发病率占全部乳腺癌的15% ~ 25%，在我国的发病率约23.8%[8]，而目前 临床上针对T N B C尚无有效的靶向药物，值得注 意的是，50% ~75%的TNBC发现有EGFR表达[9]，提示E G FR有望成为TN BC的靶点[|°]，以EGFR为靶点的化合物或可成为TNBC的候选 化合物。
靶向药物筛选模型的建立是新型靶向候选化合 物发现及其作用机制研究的前提和基础目前针对药物筛选主要有计算机辅助药物筛选、基因芯片 和蛋白芯片技术、萤光素酶（luciferase,L u c)报告基 因高通量筛选等。计算机辅助药物筛选具有高效的
收稿日期：2020-07-15；接受日期：2020-09-22
基金项目：国家自然科学基金（SM60561)
来电不善电影作者简介：梁丹丹（1993 -)，女，河南周口人，硕士研究生
T el：132****2826；E-mail：*****************
*通讯作者，侯华新，E-mail: *****************筛选性能，但无法模拟细胞内活性分子的功能；基因 芯片和蛋白芯片技术虽可以直接反映药物作用的靶 点和药物作用机理，但技术难度较高，一定程度上限 制了其应用；报告基因（reporter g e n e)是一类易于被 检测的酶或蛋白的基因，采用D N A重组技术与目的 基因相连接形成嵌合体。由于报告基因反应迅速，可快速实现对目的基因的检测[12]。L u c是目前最为 常用报告基因，具有特异性强，灵敏度髙，不受激发 光干扰等优点[13]，在体外药物筛选中可实现高通量 操作，目前在靶点的筛选和验证应用中越来越广泛，但国内外尚未见以E G F R为靶点的T N B C的L u c报 告系统构建。本研究以T N B C来源的M D A-M B231细胞作为研究对象，利用重组慢病毒载体构建稳定表 达人E G F R启动子和L u c报告基因的细胞系，通过分 析细胞内L u c活性与E G F R激活剂和抑制剂调控的 关系，验证其稳定性和敏感性，为靶向E G F R的抗肿 瘤化合物的筛选及修饰提供一类新的细胞模型。
1材料和方法
1.1材料
慢病毒表达载体 p C D H l-C M V-Luc2-E F l-c o p G F P +
10期梁丹丹，等.含表皮生长因子受体（EGFR)启动f萤光素酶报告基因的三阴性乳腺癌细胞模型的建立 919
P u r o、H E K293T细胞、感受态细胞Stabll3由上海交 通大学金卫林教授课题组惠赠；人T N B C
M D A-M B231细胞由广西肿瘤防治研究所传代保存；胎牛血清(fetal bovine s e r u m,F B S)、D M E M培养基购 自G i b c o公司；嘌呤霉素（p u r o m y c i n,P u r o)、睡唑蓝
(3 -(4, 5 -dimethylthiazol-2-yl)-2, 5 -diphenyltetrazolium
b r o mide,M T T)、聚凝胺（polybrene)购自北京索莱宝 有限公司；吉非替尼购自阿斯利康公司；重组人表皮 生长因子（recombinant h u m a n E G F,r h E G F)购自R&D Systems公司；O N E-Glo™ 800 Reagent L u
c 报告基因 检测试剂盒购自P r o m e g a公司；LipofectamineIM 2000 转染试剂购自Invitrogen公司；凝胶回收纯化试剂 盒、S/>e I限制性内切酶、£c o R I限制性内切酶、T4
D N A连接酶、D N A m a r k e r购自T a K a R a公司。
1.2方法
1.2.1 E G F R-promoter-Luc2重组报告基因廣粒的构建 与鉴定以人E G F R启动子序列（-1667 bP ~ -14 b p)为靶序列，设计序列上游加人I酶切位点 (3'-A C T A G T)下游加人£c〇R I酶切位点(G A A T T C-5')，进行全基因合成，序列总长为1666 b P，获得含有E G F R启动子的质粒命名为P U c57s-E G F R-P。将该质粒与含有绿荧光蛋白(green fluorescent protein，G F P)标签和 Puro 筛选标 记的L u c报告基因慢病毒载体（P C D H1-C M V-L u c2- E F l-c o p G F P+ P u r o)采用 Spe I 和£c o R I 分别进行双 酶切获得目的片段，经过凝胶电泳回收纯化目的片 段后，在T4连接酶的作用下连接获得重组E G F R-promoter-Luc2报告基因质粒，并将重组质粒转化到 感受态细胞S t a b U3中，涂于含有氨苄青霉素培养板 筛选。挑取单克隆菌落进行扩增，提取质粒，重组质 粒采用Spe I和£C〇R I进行双酶切鉴定。
1.2.2慢病毒包装取对数生长期的H E K293T细胞，接种于60 m m细胞培养皿，于37丈、50 m l V L C〇2培养箱中培养24 h后，细胞增殖汇合达到50% 开始进行转染。首先，取1.5 p g重组质粒和1.5 p g 病毒包装质粒至400 j j l L的无血清D M E M培养基。充分混匀后，加入6 (x L的Lipofectamine1”2000转染 试剂混匀放置15 m i n；将此混合液逐滴加人H E K293T细胞中培养6 h后，更换含100 m L/L F B S 的D M E M培养基继续培养72 h。收集含病毒的细胞 上清，将病毒液经0.45 p m d/L滤膜过滤，病毒滴度 约 1x108 转导单位（transducing units,T U)/m L；分装，保存于-80T。
1.2.3 稳定转染细胞系的建立取对数生长期的 M D A-M B231细胞，以8 x104个/孔的细胞数接种到 6孔
板内。当细胞汇合度达50%时，每孔加人4
5 m g/m L的poly b r e n e后再加人500 |x L的病毒液。病毒感染24 h后，撤去病毒液，消化细胞；800 r/m i n离心10 m i n收集细胞，并将细胞重悬吹散 成单个细胞，全部接种至T75的培养瓶中；于37T、50 m I7L C02培养箱中培养24 h后，更换含有 2 j xg/mL P u r o的培养基，连续筛选1周。从而获得 稳定表达L u c的M D A-M B231细胞系，命名为M D A-M B231-E G F R-L uc2细胞系，并在荧光显微镜下观察
G F P表达情况，采用细胞计数评估病毒转染效率。
1.2.4 M D A-M B231-E G F R-Luc2 细胞 L u c 发光信号 值测定取对数生长期的M D A-M B231细胞及转染 后的 M D A-M B231-E G F R-L u c2 细胞，分别以 5 x 1〇3个/孔，1〇〇I x L接种于96孔板。细胞贴壁培养 24 h后，分别加入100 |x L溶解后的O N E-Glo™Reagent L u c活性检测试剂裂解细胞，并在酶标仪上 振荡裂解细胞5 m i n；立即检测两株细胞L u c发光信 号值，计算M D A-M B231-E G F R-L u c2细胞L u c发光信 号值的相对倍数。独立实验重复3次。
1.2. 5 M D A-M B231-E G F R-L u c2 细胞系对 E G F R 抑 制剂和激活剂的敏感性 M D A-M B231-E G F R-L u c2细 胞按照1x 104个/孔接种于96孔板中，细胞贴壁
24 h。细胞分为对照组、E G F组和吉非替尼组，其中
E G F组分别采用(5、10、20)n g/m L E G F处理30 m i n，吉非替尼组分别采用（20、40、80) p m o l/L吉非替尼 处理12 h；每组设置6个复孔，其中3个复孔用于检 测细胞L u c发光信号值；另外3个复孔加20
M T T，孵育4 h后，加100 p L D M S0，避光震摇10 m i n后，于波长为490 n m下检测细胞吸光度（A)值并测定细胞存活率。计算化合物对L u c活性影响，L u c活性=样品发光信号值/细胞存活率，细胞存活率（％)=(A样品/A空白）X100%。
1.2.6统计学分析采用S P S S17.0软件进行统计 分析。数据均采用i表示，两组间均数采用独立
样本f检验，以P<〇.〇5为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 重组质粒EGFR-promoter-Luc2的构建
重组质粒经I和I酶双酶切后理论上 应获得长度为1103 b p和3267 b P的两段D N A 片段。
920细胞与分子免疫学杂志（Chin J Cell M ol Immun 〇l )2020, 36(10)
iV 丨卜替尼处理浓度屮mol/L)
A: E G F 对细胞L u c 活性的激活作用；B ：吉非替尼对细胞L u c 活性的抑制
作用.aP <0.05, bP <0.01 w 0 ng/raL EGF 或0 jjumol/L 吉非替尼.
图3 E G F 和吉非替尼对细胞Luc 活性的影响
3
讨论
TNBC 缺乏ER、P R 和HER 2表达，因此，传统
内分泌和针对HER 2的靶向效果不佳[14]。 目前对TNBC 患者主要研究方向集中在新靶向
、免疫与新内分泌三个方面。而为了 降低毒性，促进TNBC 的个体化以改善患者的预 后，靶向成为短期内最有希望提高TNBC 患者生 存率的重要探索方向。近期的研究证实，表达EGFR 的TNBC 对埃罗替尼和帕洛基尼等EGFR 抑制剂的 较为敏感[9’15^6]。因此，发现新的耙向EGFR 的化合物对于TNBC 的具有重要的临床意义。
设计L u c 报告基因药物筛选体系，关键在于确 定与L u c 报告基因编码序列相连的疾病相关的靶基 因序列，目前已报道的L u c 报告基因药物筛选体系 主要有：①基于受体激动剂/抑制剂的筛选体 系[17_|8];②基于信号通路的筛选体系[19];③基于耙 基因 3'非翻译区（3'-untranslated regions ，3'U T R )的 筛选体系[2°_21];④基于靶基因启动子的筛选体 系[22]。前两种筛选体系是在细胞水平上以第二信使
MDA-MB231 -EGFR-Luc ：
A ：细胞G F P 表达效率• 1：荧光显微镜（X 200); 2：明场图（X 200).
B ：细胞 Luc 表达量.*^<0.01 t«MDA-MB231 细胞.
图2细胞转染效率及Luc 发光信号值检测
2.3 EGF 处理增强 MDA _MB 231-EGFR -Luc 2 细胞 L u c 活性，吉非替尼处理则相反
M D A -M B 231-E G F R -L u c 2 细胞经 E G F 、吉非替尼
EGF 处理剂 V:(ng/mL)
1 ：质粒 DNA; 2：瓦coR I /Spe I 双酶切重组质粒 EGFR-promoter-Luc2;
M ： DNA marker.
图1 重组质粒E G F R -p r 〇m 〇ter-LUC2质粒双酶切电泳图
2.2 MDA -MB 231-EGFR -Luc 2 细胞系的建立
采用p u r e 连续筛选1周后，获得MDA-MB231-
E G
F R -L u c 2细胞系，荧光显微镜下可见细胞表达
G F P ，转染率在90%牛顿第二定律教案
以上（图2A )。L u c 发光信号值
测定结果表明，M D A-M B231-EG FR-L ik ;2细胞的Luc 活性是M D A -M B 231细胞的41.8倍（图2B )，表明人
E G
F R 启动子L u c 报告基因稳定转染细胞系建立
成功。
电泳结果显示，3000 b p 和1200 b p 附近可见到两个
明亮的条带，与重组EGFR -promoter -Luc 2质粒经双酶 切后的片段大小一致，表明目的序列成功插入且序列大 小正确（图1 )，L u c 报告基因重组质粒构建成功。
1
2
M
bp
4500300020001200800
处理后，Luc 活性检测发现，随着EGF 剂量的升高，
视频直播服务器
细胞Luc 活性增加，其中20 ng/mL 的EGF 可使Luc 活性上升1.27倍；而加人不同浓度吉非替尼则能明 显降低细胞Luc 的活性，在80 pmol/L 的吉非替尼作 用下，细胞Luc 活性下降约20% (图3)。
o o o
o
o o
o o o o
8
176
5
4
B
10期梁丹丹，等.含表皮生长因子受体（EGFR)启动子萤光素酶报告基因的三阴性乳腺癌细胞模型的建立921
在细胞核内的应答元件为靶序列，构建L u c报告基 因药物筛选系统，根据L u c活性反映细胞第二信使 水平的变化情况，但由于第二信使在同一细胞与多 条信号通路存在交叉关联，同时第二信使水平的变 化也可以影响多种细胞膜受体的激活以及抑制状态。因此，这类方法在一定程度上降低了药物筛选的靶 向性，需结合其他活性筛选方法加以验证。第三种 以基因3'U T R序列为调控序列构建L u c药物筛选体 系是一种新的药物筛选设计方法。如韦忠红等[23]以肿瘤坏死因子 a(tumor necrosis factor a,T N F-a)基因 3'U T R为药物作用靶点，基于L u c报告基因法筛选 对T N F-a具有转录抑制活性的天然产物。该体系可 以筛选出对T N F-a基因具有转录后水平调控活性的 化合物，但一个基因m R N A的3'U T R可以有多个微 小R N A(m o c r o R N A，m i R N A)与之结合并弓丨起靶基因 的翻译抑制和降解，而一个m i R N A分子又可以与多 个靶基因的3'U T R结合。因此，以基因3'U T R序列 为调控序列药物筛选体系可能会导致假阳性或者假 阴性结果的出现。启动子是R N A聚合酶特异性识别 结合的一段D N A序列，虽然不直接编码蛋白，但是 直接控制基因转录活动的起始。启动子序列上分布 着大量转录调控元件，当受到外界刺激时，细胞内的 转录因子与启动子序列上的转录调控元件发生特异 性结合，从而引起基因的转录激活或者抑制，进而调 控基因的蛋白表达水平。因此，基于靶基因启动子
的靶向药物筛选体系与上述3种体系相比具有一定 的优越性，可以特异性筛选引起目的基因转录活性 改变的活性小分子。由于75%的T N B C患者E G F R 过表达，部分患者对第二、第三代E G F R抑制剂的治 疗较为敏感，且目前尚缺乏针对T N B C E G F R启动子 L u c报告基因靶向药物筛选的相关研究，故建立针对 E G F R启动子和L u c报告基因的药物筛选体系十分 必要。
由于基因启动子序列分布范围较广，而L u c基 因载体对插人的外源序列有一定的长度限制，目的 基因启动子序列的长度需要控制在合适的范围内才 能保证重组报告质粒的成功构建。E G F R启动子上 游-1109〜-16 b P这一片段受到转录因子早期生 长应答基因 1(early growth response 1，Egr-1)的转录 激活调控，属于转录活性区，-481 b P〜-384 b P这 一段序列为转录调控因子E gr-1的结合序列，为E G F R表达的核心序列，而-1409 b P~ - 1109 b p启动子区存在两个增强子[24]。因此，我们截取了包含 启动子序列在内的-1667 b P ~ - 14 b P区域内的 E G F R基因启动子序列构建L u c报告基因重组表达的慢病毒载体。同时该慢病毒载体还携带有P u r o抗 性，含G F P L u c报告基因，转染细胞后不仅利于目的 细胞的筛选，更便于实时荧光显微镜动态监测[25]。本研究构建的M D A-M B231-E G F R-L u c2细胞系在荧 光显微镜下可观察到较强且均匀分布的绿荧光，病毒的转染效率达到了 90%以上，与朱含章等[26]、苏玉金等[27]采用慢病毒载体转染细胞的转染率相 似。同时对转染细胞的L u c活性测定，结果发现 M D A-M B231-E G F R-L u c2细胞L u c活性是未转染细胞 的41.8倍，表明稳定表达E G F R启动动子及L u c报 告基因的T N B C细胞系构建成功。
本研究分别以不同剂量的E G F和吉非替尼处理 细胞，对构建M D A-M B231-E G F R-L u c2细胞系的应用 进行初步验证，L u c结果与激活剂E G F、抑制吉非替 尼的功能完全吻合，然而该细胞模型在应用于靶向 E G F R化合物筛选过程中，细胞的数量、受试物的浓 度、受试物的作用时间等条件仍有待进一步的完善 和探讨。
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