2021年34卷4期西"农业学&
Vo e.3444No.4SouthwestChinaJouenaeoeAgeicuetueaeSciences911文章编号：1001-4829(2021)4-09II-04DOI：10.16213/jki.scjas.202I.4.032
大肠杆菌和金黄葡萄球菌对
丁志伟，杨大平，王永生，杨伟克，高建华
(云南省农业科学院蚕桑蜜蜂研究所，云南蒙自661101)
摘要：！目的】研究喂“不同细菌后，家蚕不同组织ALP酶活性D化规律，明确ALP在家蚕抵御细菌侵染过程中发挥的功能和作用，为揭示ALP在昆虫体内的生理功能及选育抗细菌病蚕品种提供借鉴和思考&［方法】分别经口喂“大肠杆菌和金黄葡萄球菌，采用微量酶标法检测家蚕血淋巴、中肠、马氏管和脂肪体ALP酶活性DY情况&【结果】中肠组织ALP酶活性在喂“不同细菌6h就开始逐渐！加，在12h达到最高值，随后急剧减弱，在24h略低于对照组，而在48h是机显著低于对照组水平&血淋巴ALP 酶活性仅在喂“不同细菌24和48h机显著高于对照组。喂“大肠杆菌和金黄葡萄球菌3和6h，马氏管ALP酶活性无显著D 化，从12h酶活性开始！强,24h酶活性机显著高于对照组；而在48h酶活性受到抑 制，显著低于对照组。不论是大肠杆菌处理组还是金黄葡萄球菌处理组，家蚕脂肪体ALP酶活性逐渐受到抑制，在12h开始显著低于对照组，并随着处理时间的推移持续减弱，在24和48h酶活性机显著低于对照组。【结论］大肠杆菌和金黄葡萄球菌侵染家蚕，脂肪体ALP酶活性受到一定程度的抑制，而中肠、马氏管和血淋巴ALP酶活性呈现先显著升高，后急剧降低的变化趋势，暗示家蚕中肠、马氏管和血淋巴ALP可能参与了蚕体抵抗细菌侵染的免疫疗御反应&
关键词：大肠杆菌；金黄葡萄球菌；家蚕；碱性祷r酶；酶活性
中图分类号:S881文献标识码:A
Efecis of Escherichia coli and Staphylococcus aureus on AlUaline Phosphatase Activity in DiffererS Tissces of Bombyx moei
DING Zhi-wei,YANG Da-ping,WANG Yongwheng,YANG Wei-ke,GAO Jian-hua*
(Institute of Seiculture and Apiculture,Yunnan Academy of Agricultural Sciences,Yunnan Mengzi661101,China)
Abstract：【Objective]In order h provide reference and thinking As revealing the physiological funcCons of ALP in insects and breeding silk-woem eaeietieseesistanttobacteeiaediseases,westudie
d thechangesoeaekaeinephosphatase(ALP)actieityin di e e eentti s uesoesiekwoem aftes feeding dPemnt bacteria,and claified the function and mle of ALP in We process of resisting bacterial inAction-【Method]The chan-gesoeALPeniymeactieityweeedetected bymiceo-eniymea s ayin hemoeymph,midgut,maepighian tubueeand eatbodyoesiekwoem eaeeae after feeding Escherichia li)and Staphylococcus aureus.【Result]In We mpgut,the ALP enzyme activity was graduW l y increased at6hours after feeding p and the Staph-ylococcus aureus,reached a m—imum value at12hours,then decreased sha/ly and was seighte eoweethan thatoetheconteoegeoup at24houes,and wassignieicanteeoweethan thatoetheconteoegeoup at48houesaeteeeeedingthe
hours wiP d treatment group and the Staph-ylococcus auru treatment group.There was no significant change of ALP enzyme activity in maepighian tubueeat3and6houesateeeedingdieeentbacteeia,theeniymeactieitybegan toinceeaseat12houesand wassigniicantey higheethan theconteoegeoup at24houes,buttheALPeniymeactieitywassigniicanteyeoweethan thatoXtheconteoegeoup atee48houes.
Both with p Weatwent and Staph-ylococcus aureus treatment,We ALP acCvity was graduW l y inhibited in fat body of silkwown and sig-niicanteyeoweethan thatoXtheconteoegeoup at12houesand continued toweaken with theteeatmenttime,and wassigniicanteyeoweethan that of the control group at24and48hours.【Conclusion]li or Staphylococcus aureus infected the silkwown,the ALP activity showed atend oemaYkedeyinceasingeistand then shaYpeydecYeasingin midgut,maepighian tubueeand hemoeymph,whieetheeatbody
收稿日期：2020-11-20
基金项目：云南省现代农业蚕桑产业技术体系建设项目(2019 KJTX006)
作者简介：丁志伟(1980-)，男，云南楚雄人，本科，实验师，研究方向为桑树田间管理及病虫害防治，E-mail：DZW198005@ 163-cm；*为通讯作者：高建华,E-mail：cfyjs_h@163-com。ALPactieitywasinhibited toacetain degYee.Itsuggested that theaekaeine phosphatase in midgut,maepighian tubuee and hemoeymph oesiekwoYmpeayed an impotantoeein theimmune deeense esponsetobacteYiaeineection.
Key words:EscheUchio cop；Staph-ylococcus aureus;Bombyx mori；Alkaline phosphahse；Enzymatic activity
912!"#业学&34卷
【研究意义】碱性磷酸酶ALP（Alkalina phospho-tasa）作为生物体内一类高度保守的磷酸水解酶，其主要功能是催化磷酸单脂水解，参与机体磷酸基团的代谢过程，而且还参与了昆虫机体的解毒代谢和免疫防御过程［1'2］o ALP广泛存在于昆虫的头、脂肪体、血淋巴、肠道、表皮、马氏管、生殖腺和唾液腺等部位。家蚕（Bombyx mori）是一种吐丝营茧的经济昆虫，其ALP酶活力大小与蚕体强健性和抗性强弱密切相关，一般情况下，蚕体ALP活力越高，其幼虫生长发育健康齐一，蚕体抗逆性越强，茧丝产量高［3—4］（【前人研究进展】昆虫遭遇细菌等病原微生物侵染时，机体正常的物质和能量代谢过程受阻，溶菌酶、解毒酶和水解酶等相关酶的活性也会发生一定的变化［5］（ALP被认为是一类与昆虫抗性密切相关的水解酶［6］（用低剂量的螟硫磷处理云杉卷蛾，其血淋巴和中肠/LP基因被显著上调，编码的碱性磷酸酶活性也显著高于对照组［7］（研究发现，棉铃虫ALP酶活性越高，其机体对有机磷农药的水解能力也越强；与敏感品系相比，对除虫菊酯具有抗性的棉铃虫中肠ALP酶活性显著增加［8-9］。棉铃虫遭受HexrNPV侵染后，机体ALP的活性被显著抑制，且抑制作用与感染病毒的剂量和感染后时间的增加呈正相关［10］。而在对家蚕的研究中发现, BmNPV感染家蚕幼虫后,ALP活性及其基因的表达量在感染中期增加，感染后期会急剧减弱［11］（用病原微抱子虫N.b和SCM6交叉感染4龄家蚕，中肠ALP酶活性呈现先迅速升高，随后急剧降低的趋势&12'（另外，家蚕在遭受苏云金芽抱杆菌或黑胸败血芽抱杆菌感染后，机体ALP酶活性呈现先逐渐增强后急剧减弱
的的变化趋势，这暗示碱性磷酸酶在家蚕抵御病原微生物侵染过程发挥了一定的功能&【本研究切入点】细菌病是家蚕饲育过程中较常见的病害，具有一定的传染性，危害严重，每年给蚕农带来严重的经济损失［15］（抗菌肽、热激蛋白和酚氧化酶等免疫应答因子参与家蚕抵御细菌侵染的研究已有大量报道［16-18］，而关于ALP在家蚕抵御细菌侵染过程中的生理作用及分子机制的研究鲜见报道。【拟解决的关键问题】研究家蚕经口感染大肠杆菌和金黄葡萄球菌后，机体不同组织ALP酶活性变化规律，明确ALP在家蚕幼虫抵御细菌侵染的免疫应答过程中发挥的作用，为深入解析家蚕碱性磷酸酶ALP的生理功能奠定基础，为筛选和培育强健性多丝量家蚕新品种提供理论依据。
1材料与方法那一次我很受启发
1-1供试材料
家蚕品种：菁松，由云南省农业科学院蚕桑蜜蜂研究所质检中心保存和饲育。革兰氏阴性菌大肠杆菌（EscRericRia cop）和革兰氏阳性菌金黄葡萄球菌（Staphylococcos aureus），由云南省农业科学院蚕桑蜜蜂研究所家蚕病理研究室提供。
主要仪器及试剂：The/noFisher高速冷冻离心机,BUTek Syneryo2多功能酶标仪。BCA蛋白测定试剂盒（碧云天生物技术有限公司生产，型号P0006）。碱性磷酸酶活性测试盒（北京索莱宝科技有限公司生产，型号BC2140）。
1-2试验方法
1.2.1菌种培养用高压灭菌的牙签在LB固体培养基平板上挑取单菌落，放入试管中，加入适量LB液体培养基,37t振荡培养10-16h。取200-500#菌液，加入装有10mL液体培养基的试管中，继续培养至OD600值约为0.5，血球计数板计数并测算菌液浓度，转移至5mL离心管中，3500s•min"离心15mU，弃上清，用昆虫生理盐水悬浮菌体，使其浓度为2X108个•mL-1。
1.2.2添食细菌及采集样晶参照杨伟克［19］文献报道的方法：分别将浓度为2X108个•mL"的大肠杆菌和金黄葡萄球菌悬液，用微量移液器经口喂食5龄第3天家蚕幼虫，每头家蚕喂食5#R以喂食等量的生理盐水为对照组。在喂食不同细菌后的3、6、12、24和48h，解剖家蚕幼虫，取其血淋巴、中肠、马氏管和脂肪体，样品收集后用液氮冻存。1.2.3酶活性测定分别取中肠、马氏管和脂肪体0-y迅速放入玻璃匀浆器中，加入预冷PBS缓冲液1mL，在冰上充分研磨匀浆，随后将匀浆液倒入2 mL的离心管中，在4t条件下，转速4500s•min"离心10-15mU，上清液转即为待测酶液。
取250#i家蚕血淋巴，加入预冷PBS缓冲液750#R在4t条件下，转速6000s•min"，离心15 -20mU，弃沉淀留上清液，即为待测酶液。
利用BCA蛋白测定试剂盒测定各样品蛋白浓度，根据碱性磷酸酶测试盒操作说明测定并计算各个样品的ALP酶活性。
1-3数据分析
阔里吉思
利用Excel2016记录数据并计算，GraphPad P/sm5对数据进行统计分析和作图。
2结果与分析
2.1不同细菌对家蚕血淋巴碱性磷酸酶活性的影响
如图1所示，与对照组相比，喂食大肠杆菌组和食金葡萄球菌，家虫血ALP酶活性在3、6和12h均无显著变化。而在24和48h ,
4期丁志伟等：大肠杆菌和金黄葡萄球菌对家蚕不同组织碱性磷酸酶活性的影响
9I3
•50-50-5o 2 2 L L 0
(L F e
ffl 史a
疊s ffl
握
处理时间(h )
Treatment time
A .t:A
€e
(L F e
ffl 史a 疊
s ffl t
0.80.6
0.40.20
"对照组
萄球菌
12处理时间o )
Treatment time
2448
36较，* 示差异显著！P<0.05), * *表示差异极显
著(P<0.0I )，下同
Compared with the control group , * indicated significant dikemncc (P V 0.05 ) , and * * indicated extreme significance ( P < 0. 0I )- the same as below
图1喂食不同细菌后家蚕血淋巴ALP 活性变化
Fig. I Changes of ALP activitg in hemolymph of silkworm after feed
ing dRferent bacteias
•50-50-5o 2 2 L L 0
吉上u e (
L F e
ffl 史a 疊
s ffl ®
"对照组
口大肠杆菌
匸金黄葡萄球菌
由
f t
3 6 12 2
4 48
处理时间(h )
Treatment time
图2喂食不同细菌后家蚕中肠ALP 活性变化
Fig. 2 Changes of ALP activitg in midgut of silkworm after feeding
dike/nt bacteria
论是大肠杆菌处理组，
金葡萄球菌处理
,ALP 酶活性均显著高于
(P<0.05)。
2 - 2
同细菌对家蚕中肠碱性磷酸酶活性的影响
由图2结果显示，中肠ALP 酶活性在喂食大肠
杆菌和金黄葡萄球菌后3 h , 无显著
异,6h 酶活性开始显著 (P <0.05)，且
I2 h 酶活性均极显著高于 (P <0.01 )(在
24 h 大肠杆菌处理组和金黄葡萄球菌处理组的
ALP 酶活性均呈现减弱趋势，但
无
显著差异。在48 h 菌处理组的ALP 酶活性均极 显著低于
(P<0.0I )(
2-不同细菌对家蚕马氏管碱性磷酸酶活性的影响
1.81.2
0.6
A
.t:A €e
(
L F e
ffl 史
a
疊
s ffl t
由图3可知，在喂食大肠杆菌和金黄葡萄球
处理时间(h )
Treatment time
图3 同细菌后家蚕马氏管ALP 活性变化
Fig. 3 Changes of ALP activitg in malphigian tubule of silkworm af
ter feeding dikemnt bacteria
图4喂食不同细菌后家蚕脂肪体ALP 活性变化
Fig. 4 Changes of ALP activitg in fat body of silkworm after feeding
dike/nt bacteria
菌后3和6 h ，马氏管的ALP 酶活性与对照组相比 没有显著变化，I2 h 酶活性开
，与
异显著(P<0.05), 24 h 酶活 显著高于
对照组(P <0-1 )。在喂食不同细菌后48 h , ALP
酶活性开始显著
， 异达到显著
水平(P <0.05 )。
的时间范围内，喂食
菌后家蚕马氏管ALP 酶活性整体呈现先 【后
减弱的变化趋势。2. 4 同细菌对 蚕
体碱性 酸酶活性的
响
如图4所示，不论是大肠杆菌处理组还是金黄
葡萄球菌处理组，家
肪体ALP 酶活性逐渐被
制，随着 的 ，酶活 减弱。脂肪
ALP 酶活性在3和6 h 略低于对照组水平，
I2
h 酶活性开始显著降低，大 杆菌处理组和金黄
葡萄球菌处理组的ALP 酶活性分别下
的59 %和65 %，差异达到显著水平(P<0.05)；而
夜莺的歌声教学设计24和48 h ,ALP 酶活性持续低于
，且 异
达到极显著水平(P<0-I )(
六氯环己烷3讨论
昆虫碱
酶不仅
的物质代谢、调
平衡，而且
的解毒
和免疫
I
过程。 盗食 菊酯
虫剂的 ，
中肠和脂肪体ALP 基 达量
，其编码的碱性
阿托品试验
酶活性显著上升&20'。 虫菊酯具 的
铃虫中肠ALP 酶活性显著高于 系&9'。于
欢等人发现，棉铃虫幼虫感染He —NPV 后，其
的ALP 活性被显著抑制，且 制作用 染病毒的剂量和感染 的 呈 &10'。家 染
苏云金芽抱杆菌(Bocillus thuringiensis )和质型多角
西安建筑科技大学张婷
体病毒(Cytoplosmic polyhedrosis virus ) , ALP 酶活性 呈现先显著升高，随 减弱的变化趋势&13「14'。家蚕遭受BmNPV 感染后，各
碱 酶活性基因的表达量 染中期
，感染期 .
剧减弱，这明ALP 很可 家
BmN
914西"#业学&34卷
PV侵染的免疫防御反应[11](
本研究结果显示，不论是喂食革兰氏阴性菌大肠杆菌还是革兰氏阳性菌金黄葡萄球菌，家蚕血淋巴、中肠和马氏管ALP酶活性整体呈现先增加后减弱的变化趋势。在测定的时间范围内，经口喂食不同细菌，其最先接触和刺激中肠，中肠组织ALP 酶活性在喂食细菌后6h就开始逐渐增加，马氏管和血淋巴ALP酶活性分别在感染细菌后12h和24 h才开始显著增强。说明蚕体不同组织ALP对细菌侵染的响应不一致。另外，大肠杆菌和金黄葡萄球菌对脂肪体ALP酶活性具有显著的抑制作用，并随着时间
的延长，酶活性急剧减弱。家蚕脂肪体可以分泌抗菌活性因子参与机体免疫防御过程；另外，家蚕的脂肪体含有许多酶系，对蚕体代谢起着重要作用。当用大肠杆菌和金黄葡萄球菌侵染家蚕时，引起宿主脂肪体内免疫调控途径的变化，直接或接制ALJ中酶活
的变化。
4结论
用大肠杆菌和金黄葡萄球菌经口侵染家蚕，不同组织器官ALP酶活性变化规律及其对细菌的响应时间和受影响程度并不一致。添食不同细菌，家蚕中肠、血淋巴和马氏管ALP酶活性呈现先显著升高，后急剧降低的变化趋势，而脂肪体ALP酶活性从12h开始显著降低，并一直处于被抑制状态。提示中肠、血淋巴和马氏管ALP在家蚕抵御细菌侵染的免疫防御过程发挥了一定的作用，具体的作用机制有待深入研究。
参考文献：
[1]Yan Y，Peng L，Liu W X,et al.Research progres s in insect alka
line phosphaOses&J]-Acta Entomologica Sinica，2009，52(1):95 -105.
[2]Da Silva G，Costa Ramos L F，Dos Santos S H，et al.Biochemical
chaeacteeization oedige2tieemembeane-2ociated aekaeinepho2phata2e from the velvet bean caODiDar/nacarOa gemmatalis&J] -Arch In-sectBiochem Physioe，2019，102(11):1-14
*
[3]，罗英，鲁成，等•家蚕碱性磷酸酶的分离纯化与部分性质&J]-西南师范大学学报，2005,30(5):930-934.
[4]何华伟，王叶菁，侯丽，等.家蚕碱性磷酸酶原核表达纯化、结
构与活性分析&J]-中国农业科学,2017,50(14):2837-2850.
[5]付盈盈，马玉y，任淑文，等-革兰氏阳性菌苏云金芽抱杆菌和革
兰氏阴性菌大肠杆菌诱导的柞蚕蛹生理指标变化&J] •昆虫学报,2016,59(2)：192-199-
[6]Haeipeasad TPN，She t yNJ.Biochemicaebasisoeaephamethein ee-
sistance in dUferent life stages of AnophePs strains of Bangalore，India&J]-Pest Ma/ag SC，2015,72(9):1689-1701. [7]Leclair G，Williams M，SilO P，et al.Spocc Budworn(LepiUopter-
a:Toeteicidae)OeaeSeceetions I:Chemistey[J].Eneieonmentae Entomology，2015,44(6)：1531-1543.
[8]Yang Y H,Li YP,Wu Y D.Current status of insecticide resistance
in Relicovepa aomgeo Oter15years of Bt cotton planting in China [J] .Jou ena eo eEconomic Entomo eogy,2013,106(1):375-381.
[9]张涛，张丽丽，魏纪珍，等.C d1A c抗、感棉铃虫碱性磷酸酯酶(ALP1)的表达量比较&J]-中国农业科学,2013,46(17):3580 -3586.
[10]于欢，吕婷婷，李晓峰，等-HeoDPV侵染对棉铃虫中肠碱性磷酸酶活性及表达水平的影响[J]-西北农林科技大学学报,
2012,12(40):127-130.
[11]高建华，杨大平，杨伟克，等-BmNPV对家蚕不同组织ALP活
性及其基因表达的影响&J]-西南农业学报,2020,33(5):1101 -1104.
[12]孙毅，李娜，潘敏慧.N.b和SCM6交叉感染对家蚕中肠碱
性磷酸酶活性的影响&J]-蚕学通讯,2007,27(4):12-15-[13]MiaoYG.Studieson theactieityoetheaekaeinephosphatasein the
midgut of infected silkworm,Bombpp mop[J]-Journal of Applied Entomoeogy,2002,126(1):138-142.
[14]李文楚•软化病感染家蚕的碱性磷酸酶活力测定及病理学研究&J] •华南农业大学学报(自然科学版),2004,25(4":120-122.
[15]王永生，范永慧，刘位芬-家蚕细菌性肠道病的发生与防治&J]-云南农业科技,2019(4):52-53.
[16]杨伟克，唐芬芬，刘增虎，等•喂食细菌对家蚕血淋巴酚氧化酶活性及其基因表达的影响&J]-中国农学通报,2019,35(5":
160-164.
[17]吕丁丁，耿涛，侯成香.家蚕抗菌肽ccyUA的表达特征及其体内外抑菌研究&J]-基因组学与应用生物学,2016,35(6":
1368-1376.
[18]陈鹏宇，李德臣，吴凡.家蚕热激蛋白的研究进展[J]-生命科学,2020,32(2):155-161.
[19]克，芬芬，刘虎,.食菌家血酚氧化酶活性及其基因表达的影响&J]-中国农学通报,2019,35(5":
160-164.
[20]Haseeb J,Muhammad N A,Zunnu R A,et al.Insecticidal toxicity
uptothied teophiceeeee:AcasestudyoeCypeemethein and Bieenthein [J] .InteenationaeJouenaeoeEntomoeogyReseaech,2017,2(4):25 -30.
(责任编辑赵丹丹)
豫公网安备41160202000603
站长QQ:729038198
关于我们
投诉建议