山西医科大学学报，2020年12月，第51卷第12期-—71-
贝那普利对肝纤维化大鼠ROS、GSH浓度及NrO表达的影响 第四范式>tiammao
杨姗姗，申风俊*(山西医科大学第一医院消化科，太原630001;*通讯作者,E-maiR9-0-603@qq)
摘要：目的研究贝那普利对肝纤维化大鼠活性氧簇(ROS)、还原性谷胱甘肽(GSH)及核因子E2相关因子2(Nr/)的影响，探究其对肝脏的保护作用及可能机制。方法将22只健康雄性SD大鼠随机分为3组：对照组6只、模型组3只、组3只。模型组及组均给予皮下注射40%CCi4油剂，对照组予以相同剂量的油剂皮下注射2次/周；组从实验开始给予贝那普利灌胃，直至实验结束，余两组均予以同剂量生理盐水。比法测定血清GSH及ROS的浓度.real-Cmc PCR检测肝组织NeemRNA的表达量。结果与对照组相比，模型组ROS的浓度及NrfmRNA的表达量均升高，差异有统计学意义(P<0.05),GSH的浓度有升高趋势，差异无统计学意义(P>0.05)。与模型组相比，给予贝那普利后，组ROS的浓度降低(戸<0.05)山/4mRNA的表达量升高(P<0.05),GSH的浓度有升高趋势，差异无统计学意义(P>0.05)。结论贝那普利可能通过降低血清ROS的浓度、增加NO的表达，减缓肝纤维化的进展以保护肝脏。 关键词：肝纤维化；贝那普利；还原性谷胱甘肽(GSH)；活性氧簇(ROS)；核因子E2相关因子2("/)
中图分类号：R475文献标志码：A文章编号：1097-6611(2929)14-—51-94DOI：19.13753/j.R w u1097-6611.2929.14.912
Effects of benazerril on ROS and GSHand NrO expression in hepatic OOrosit rota
YANG Shanshau,SHEN FenUuu*(DepaOment cf Gastroecterolofy,Firsi Hospital of Shanxi MeCical University,Taiyuan030001, China；*Cofesponning autOoe,E-mail:619016600@qq)
Abstroch:Objectiee To stuPy the eOects of bedazeprii on reactive oxyyeo species(ROS),reOuceO yluWthionc(GSH)and uucle7r fachr-relahd factor9(NO/in hepatic fib/tio rats,and to explore Js prohctive eOect on/ver and its possidlo mechanism.MetOofs Tweoty-two hea/hy male SD rats were randomly divideO into three y/cps:control yroup(n=6),moCci yroup(n=8)and beoaze-prii yroup(n=8).The rats in both moCci yroup and beoazepei yroup were suPcyWneously injechO with40%CC/oil twice one weeP, while the rats in control yroup were suPcytaneously injected with the same dose of oil.The rats were Pt/vastPcahy aCmPist/hd with beoazeprii from the beyining to the eod of the experimeot in beoazeprii yroup,and the same dose of uormai sa/ue in the other two yroups.The conceoWa/ons of serum GSH and ROS were dehrmi/eO by celorimet/,and the expression of N/4mRNA in/ver tissues was dehcteO by real-Cme PCR.ResuUs CompareO with control yroup,ROS conceotrahon and NO mRNA expression were sWhsti-cahy iucreased in moCel yroup(P<0.05/:while GSH concentrahon tended to i/crease,but the diRereuce was uot sWtisthahy signifi-cant(P>0.05).CompareO with moCel y/up,ROS conceoWa/on was significantly decreaseX in b
eoazeprii yroup(P<0.05),the expression level of N/4mRNA was stahsthahy iuc/aseX(P<0.05/:and the conceotrahon of GSH showeP uo significant change(P> 0.05).Cofclusiof Beoazeprii may slow dowu the proyression of/ver fibrosis to protect the/ver by decreasing the conceotrahon of ROS and i/creasing the expression of NO.
Key wordt:/ver eibrosis:beoazeprii,reOuceO ylutathione；reactive oxyyeo species:nuyear facWmmQwX factor9
肝纤维化(hepatic fid/sis,HF)是慢性肝病向肝硬化进展的早期的、可逆的、复杂的病理生理阶段。研究表明，肝脏中存在局部肾素-血管紧张素系统(RAS)，正常生理状态下，肝脏中即能检测出RAS 相关成分，而病理状态下其含量亦会发生变化［］。肝脏损伤时，局部RAS的激活可通过血管紧张素转化酶(ACE)-血管紧张素n(Any n)-血管紧张素m型受体(AT1R、经典轴，促进肝纤维化及肝脏炎症的进展,An)n作为经典轴中的重要效应因子，可诱导ROS大量产生，作用至关重要［］。肝纤维化的发展与氧化应激密切相关，过量的活性氧簇(ROS)堆积是氧化应激的主要特征，核因子E2相关因子9 (N/O)是体内重要的抗氧化应激的核转录因子，可在氧化应激状态下激活，通过调节其下游的多种抗氧化基因的表达，发挥抗氧化应激作用，调节肝脏的氧化应激平衡，以阻止肝纤维化的进展［］。人体内 基金项目：山西省自然科学基金资助项目(24170/121—8)
作者简介：杨姗姗，女，-95-01生，在读硕士,E-maiR2426037-9@qq 收稿日期：2220-07-13
-1826-J Shani Med Univ,Dec2020,VP51No12
具有复杂的抗氧化应激系统，除NkO信号通路外，还原性谷胱甘肽(GSH)作为体内最丰富的非蛋白硫醇，具有抗氧化应激、抗炎、解毒、调节细胞凋亡等作用，在肝脏疾病的发生发展中亦发挥着重要作用⑷。贝那普利是临床上常用的一种血管紧张素转化酶抑制剂(ACEI)，可以有效地阻止血管紧张素I(Any l)向血管紧张素n(Anyn)转化，安全性好，目前主要应用于心血管系统疾病的，因此本实验拟通过建立CC/诱导的肝纤维化大鼠模型，以观察贝那普利对肝纤维化大鼠血清ROS、GSH浓度及肝组织NkO表达的影响，探讨其对肝脏的保护作用及可能机制，为肝纤维化提供新思路。
1材料与方法
11实验动物及材料
清洁级健康雄性SD大鼠购置于河北医科大学实验动物中心;ROS比法试剂盒购置于上海西唐生物科技有限公司；还原性谷胱甘肽比法测试盒购置于南京建成生物工程研究院；随机引物、dNTP、反转录酶、RNA酶抑制剂购置于上海生工生物科技有限公司；CC/购置于天津市风船化学试剂科技有限公司；贝那普利购置于北京诺华制药有限公司。12动物处理
将26只健康雄性SD大鼠(130-612y)随机分为3组：对照组4只，模型组2只，组2只。模型组及组均给予皮下注射47%CC/油剂，(周2次，初始剂量为5m/hy，后按6m/ky注射，称重1次/周，据体重的变化调整CC/的剂量，对照组予以同剂量油剂腹部皮下注射；组自实验第1天起即给予贝那普利(—my/ky)灌胃，余两组均予以同剂量生理盐水，直至实验结束。在造模及过程中，模型组及组均有2只大鼠死亡。三组大鼠均给予正常饮食，于第2周末分别处死对照组、模型组、组大鼠6只，留取血清及肝组织备用。
18比法测定血清ROS及GSH的浓度
按照ROS的比法试剂盒说明书测出吸光值，根据标本吸光值应用计算机软件计算出相应的ROS浓度。根据GSH试剂盒说明书配制标准品溶液，测出标准0D值、空白OD值及标本血清0D值，再进一步计算出血清中GSH的浓度。
17real-time PCR检测肝组织NkO mRNA的表达量
①提取总RNA：采用T/zol试剂一步法抽取肝组织中总RNA；②测定RNA纯度：采用微量分光光度计检测RNA样品纯度；③逆转录合成cDNA：按照Feaneutas K1226反应体系进行逆转录；④采用FastStart Universal SYBR Green Master(ROX)—
反应体系进行定量测定：荧光定量PCR读取Ct(cycle thash。/)值，后根据试剂所提供的公式，求得待测肝组织NkO mRNA的表达量。real-time PCR引物序列见表1。
表1引物序列
Tabir1Primre sequence
基因序列
NkO上游：5‘—GGAGCAATTCAACGAAGCTC—3’
下游：5'-AAGTTGCCGCTCAGAACTGT—3'
B-acSx上游：—GTCAGGTCATCACTATCGGCAAT—3'下游：5'-AGAGGTCTTaACGGATGTCAACGT-3’
1.9统计学分析
所有数据表示为均数土标准差(X±0，采用SPSS26,2统计软件进行分析。计量资料组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD--法,P< 0205表示差异有统计学意义。
2结果
6.1贝那普利对血清RO2及G2H浓度的影响
与对照组相比，模型组大鼠血清RO2的浓度升高，差异有统计学意义(P<0-05)；血清G2H的浓度有升高趋势，差异无统计学意义(P>0-05，见表6)。给予贝那普利后，组血清RO2的浓度较模型组降低，差异有统计学意义(P<0.05)；血清G2H的浓度较模型组有升高趋势，差异亦无统计学意义(P>0.05，见表6)o
叶学龄
表2贝那普利对肝纤维化大鼠血清ROS及GSH浓度的影响(土S)
Tabir2Effects of benazepril on sercm ROS and GSH cancentrctione in rrtt with liver Ufrcsit((土s)组别c RO2(|jiy/ml)GSH( j mP/L)
对照组6-.59±0.8413.98±8.26
模型组6-.36±0,46*18.76±4,53
组60,72±0,44#61.20±3.53
与对照组比较,，P<0.05；与模型组比较,#P<0.05
6.2贝那普利对肝组织NkO mRNA表达量的影响
与对照组相比，模型组肝组织NkO mRNA的表达量升高，差异有统计学意义(P<0-25)；给予贝那
山西医科大学学报，2020年2月，第51卷第2期-283-
普利后，组肝组织N/4mRNA的表达量较模型组升高，差异有统计学意义（P<7.75，见表3）o
表8贝那普利对肝纤维化大鼠肝组织Nrf2mRNA表达量的影响（士S）
Table3Effectt of benazepril on Nrf2mRNA expression in liver tissees of rrtt with liver ebrrsis（（士s）
组别n NP2mRNA
对照组4012±012
模型组4 4.01±3.40*
组44164±4184#与对照组比较，，P<0.03；与模型组比较,#P<0.03
8讨论
肝纤维化是肝脏疾病早期可逆的、复杂的病理生理阶段，炎症反应、氧化应激、局部RAS的活化等均参与了肝脏疾病的发生发展九3］。局部RAS的活化与肝纤维化的发生密切相关,Ang n作为RAS经典轴中重要的促纤维化因子，可诱导机体产生ROS、刺激相关细胞（如肝星状细胞、心肌间质纤维母细胞及肾间质纤维母细胞等）活化、增殖，从而导致大量细胞外基质（ECM）的生成，促进器官组织纤维化的发展閃］。大量ROS的堆积可使机体处于氧化应激状态,Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白-1（Keap1）-核因子E2相关因子2（NPP）/抗氧化反应元件（ARE）信号通路作为机体内重要的综合性氧化还原反应体系，在抗氧化应激方面发挥着重要作用;N/P是该通路中的重要效应因子，生理状态下，位于细胞质内与Keap1结合处于非活性状态；而在氧化应激状态下，则可与Keap1解离转位进入胞核，激活ARE依赖的基因表达，如血红素加氧酶1（HOA）、谷胱甘肽过氧化物酶（GP o）、醌氧化还原酶1（NQO1）等，发挥抗氧化应激作用，以阻止肝纤维化的进展^4。我们前期实验发现大鼠肝纤维化形成过程中，肝匀浆Ang n的浓度、血清ROS的浓度及肝组织N/4mRNA的表达量均呈升高趋势，且给予贝那普利后，肝匀浆Ang n的浓度降低［52］。本实验结果显示，模型组大鼠血清ROS的浓度及肝组织N/4mRNA的表达量较对照组均升高，与前期实验结果一致，表明Ano n、ROS、Nn2均参与了肝纤维化的形成和发展。有研究［2,2］发现Ang n不仅可以使肝星状细胞活化、增殖，而且可以诱导细胞产生过量的ROS，同时对N/P及H0-1的表达有一定的抑制作用。本实验中通过给予贝那普利（临床上常用的A（CE类药物，可有效地阻止Ang I向Ang n转化，以拮抗Ang n的作用）发现，组大鼠血清ROS的浓度较模型组明显下降，肝组织NPP mRNA的表达量则升高，结合前
期实验结果表明，贝那普利确可降低Ang n的浓度，并可影响ROS的生成及NPP的表达。由此可见，贝那普利可能通过减少Ang n的生成，从而减少Ang n诱导的ROS的产生、降低Ang n对NPP表达的抑制作用，增强机体的抗氧化应激能力，减缓肝纤维化的进展，对肝脏起保护作用。
还原性谷胱甘肽（GSH）是一种主要在肝内合成的含Y-酰胺键和巯基的三肽，由谷氨酸、半胱氨酸及甘氨酸组成，具有强大的抗氧化、解毒功能，在肝细胞内储存丰富，既可直接与ROS反应发挥抗氧化作用，还可在谷胱甘肽过氧化物酶（GP o）、谷胱甘肽S-转移酶（GST）等的催化下完成；而且在多种肝脏疾病中，常表现为ROS的过量产生、GSH的减少⑷。董亚芬等［2］通过实验发现，大鼠肝纤维化形成过程中，血清GSH的水平呈升高趋势，但各组间差异无统计学意义，可能与疾病过程中GSH的逐渐枯竭有关。本实验模型组血清GSH的浓度较对照组有升高趋势，但差异亦无统计学意义，与既往实验结果一致，表明GSH在肝纤维化形成的过程中发挥着重要作用，但由于肝细胞破坏严重，GSH内源生成减少、消耗过多，血清GSH浓度升高的趋势较缓，甚至最终可能表现为血清GSH浓度降低。临床上，贲道宏［3］以酒精性肝硬化病人为研究对象，通过给予还原性谷胱甘肽单药和缬沙坦、还原性谷胱甘肽联合，发现联合患者的肝功能及肝纤维化指标，与单药患者相比有显著改善，且用药安全性、患者耐受性及依从性均较好。吕文晴等［8］则以高血压患者为研究对象，发现贝那普利联合氨氯地平的患者GPo水平较单用氨氯地平的患者升高，这一结果表明，贝那普利确可抑制机体氧化应激反应，减轻氧化应激损伤。本实验中，给予贝那普利后，GS
H的浓度也有一定升高，但差异仍无统计学意义。由此可见，贝那普利的使用可在一定程度上改善肝细胞损伤、升高血清GSH的水平，增强机体的抗氧化应激能力，从而对肝脏起保护作用，但随着肝纤维化的进展,GSH内源生成减少、消耗增多，血清GSH水平升高较缓，其对肝脏的长
-1656-J514X4)MeX Univ,Dec2020,Vol51No16
期保护作用仍有待研究。
综上所述,RAS的活化在肝纤维化进展中发挥着重要作用，尤其是Any II，而贝那普利则可通过抑制Any l的生成，降低血清ROS水平，增加NeO及其下游抗氧化基因的表达，增强机体的抗氧化应激能力，从而减缓肝纤维化的进展，对肝脏起保护作用。除此之外，随着肝纤维化的进展、肝细胞损伤的加重，使得GSH内源性生成减少、消耗过多，血清GSH水平升高较缓，甚至可表现为GSH水平下降，贝那普利对血清GSH的影响也有限。目前，还原性谷胱甘肽已广泛应用于临床，各种肝病效果显著，或可将还原性谷胱甘肽联合ACETARB类药物，作为慢性肝病患者的一种新思路，但其对患者的长期受益仍需探讨。
参考文献：
[]王琳.血管紧张素m与肝纤维化关系的研究进展[J].宜春学院学报,2918,49(3)65-67.
[2]聂琨梅，李小蕃，陈美岑，等.中药及中药提取物作用于血管
紧张素对肝纤维化的影响[J].世界最新医学信息文摘，
2915,15(98)-609.
[]白庆云•乌索酸体外通过激活N/O信号通路抑制人肝星状细胞的增殖和细胞外基质相关基因的表达[J].世界科学技术-
中医药现代化,2929,22(6)：Z49-146.
J]杨杰，丁雅雪，宗艺璇，等•天然产物通过GSH在防治肝病中的作用及机制研究[]•药学研究P929P9(4)：225-225•[5]Cha/eOee R,MiPa A.An overview of eOective therapies and re-
ceot aCvances ix bPma/ers for chrocio lives diseases and associ-
ateX lives cancel/J]-Ot(mmupopharmacol,29—,2/(2)：335-
345.
[6]Huang CY,Kuo WW,Yeh YL,C aO ANG I promotes IGF-1R
expressPc and caraiomyocyW apoptosis by PXP/Pg HSF6via
JNK actWadu and SIRT6dearaUatioc[J].Cel l DeaW DiPes,
2914,26(5)：1262-1274.
J]裴茂炜•肾素-血管紧张素系统两轴及其平衡与急性胰腺炎关系的研究进展[]•中国急救医学,2967,37(6)：594-597.
[5]姚娟，吴平安，李芸，等.Keayl-N/o-ARE信号通路及其激活
男性性工作者
剂的研究进展[]•中国药理学通报,2919,33(19):1342-
1346.
J]杨战，杨宝山，颜炳柱，等•Ke/6-Nm/-ARE抗氧化通路与肝脏疾病的研究进展[]•肝脏,29-,23(3)：266-265•[19]贺国娜，申风俊，吴龙龙.肝纤维化过程中肝组织中NO、
NOX4mRNA表达及血清ROS水平的变化[J].国际消化病
杂志,2919,57(4)：495-299.
韩国网络实名制
[16]郭芳，申凤俊，吴龙龙，等•贝那普利对肝纤维化大鼠肝组织
NOX4及Any I表达的影响J].山西医科大学学报,26—,29
(4)：337-346.
[12]陈杭萍，董文珠，曹晓倩，等•合欢皮-白蒺藜药对对Any I-
ROS诱导下HSC-LX2细胞增殖及PKC/N f R/HO-S通路的影
响[]•浙江中医药大学学报,2929,44(3)：2/6-2/6.
[-]聂佩，孟凡静2长金国，等•黄芪甲苷抑制血管紧张素I诱导的心肌H9h细胞凋亡[J].中国病理生理杂志,2919,33
(16)：1942-1959.
[14]董亚芬，申风俊•肝纤维化形成过程中血清ROS和GSH的水
平变化[]•山西医科大学学报,2919,59(16)：1352-1355. [-]贲道宏•缬沙坦联合还原型谷胱甘肽对酒精性肝硬化代偿期肝功能和肝纤维化指标的影响[J]肝脏,2919,20(16)-
牛志美1326.
[19]吕文晴，余俊键2长萍•贝那普利联合氨氯地平对高血压降压
效果及对血管内皮功能、氧化应激因子的影响[J].四川医
学,2919,29(6)：623-636.
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