实验操作记录
高压锅灭菌锅的使用
1、 将所需要的灭菌物品装好，贴上高压指示条，条的尾端要折一下，方便打开，指示条写上灭菌日期、课题组名。
2、 提起篮子，检查高压锅底部的水位是否浸过玻璃板，若未达到，需加入单蒸水。然后将物品放入高压锅，但是不能堆太高 3、 用力关紧锅盖，把左侧的气阀和安全阀关好，打开电源，把盖子拧紧，直至关门灯灭掉
4、 按“work”键开始高压
5、 高压完成后，高压锅显示END，关掉电源，待压力降为D，且温度为在60℃以下，才能取出物品。
常用试剂配方快速查阅表
试剂名称 | 原料 | 配置方法 | 注意事项 |
MTT试剂 | 5 mg/ml MTT PBS溶液 适当 | 称取MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸缓冲液（PBS）或无酚红的培养基中，用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，放4℃玻璃镀膜技术避光保存即可。 | 1、 现配现用，过滤后4℃避光保存两周内有效，或配制成5mg/ml保存在-20度长期保存，避免反复冻融，当MTT变为灰绿时就绝对不能再用了。 2、 MTT强致癌性，戴好手套 3、 MTT对细菌，配置时需无菌 4、 避光配置，锡纸包裹保存 |
完全培养基 | 10%FBS+1%双抗+DMEM 5ml FBS + 0.5ml 双抗 +45mlDMEM | |
PBS缓冲液 | | PBS粉末，定容至2L，用蓝盖试剂瓶装好，高压灭菌，4℃保存备用 | PBS是磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline）一般作为溶剂，起溶解保护试剂的作用。主要成分为Na2HPO4、KH2PO4、NaCl和KCl，由于Na2HPO4电磁炮原理和KH2PO4它们有二级解离，缓冲的pH值范围很广；而NaCl和KCl主要作用为增加盐离子浓度。注：PBS不是磷酸缓冲液（phosphate buffer solution，PB）。它具有盐平衡、可调整的适宜pH缓冲作用，蒸馏水不具有盐平衡作用，可以破坏生物蛋白的结构及生物特性；生理盐水不具有调整pH的作用，对完整的、具有活性的物质不能保证其在最适条件下参与生物反应，所以使用PBS是首选。 |
PI染液 （碘化丙啶染液） | PI | | |
PI工作液 | | | |
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原理：检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫结晶甲臢（Zā）（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲臢（Zā），用酶标仪在490nm波长处（英文说明书写的是570nm）测定其光吸收值，在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。根据测得的吸光度值（OD值），来判断活细胞数量，OD值越大，细胞活性越强（如果是测药物毒性，则表示药物毒性越小）。
准备：96孔板，培养皿、PBS缓冲液，,MTT ，DMSO、 不同浓度药物
微波热疗实验步骤：（D1种板，D2给药，D3 染测试）
1、接种细胞
取出细胞镜检，加入胰酶消化1min，后加入培养终止消化，充分吹打细胞，取100ul细胞进行计数，调整细胞浓度为1×104个/ml，接96孔板培养。 2、给药
3、MTT检测
培养24h后，取出96孔板，每孔加入配好的MTT 10ul ，混匀，继续反应4h。4h后吸干
96孔上的培养基，加入DMSO，每孔100ul，振荡10min，酶标仪490nm波长处测定吸收值。
计算IC50：抑制率为Y，加药浓度的对数为X，线性回归，根据得到的方程求得抑制率为50%时的加药浓度，也就是IC50.
注意事项
（1） 选择适当的细胞接种浓度。细胞太多敏感性降低，细胞太少观察不到差异。
（2） 实验时应设置调零孔、对照孔、加药孔。调零孔加入培养基、MTT、DMSO，不用加入细胞。其余孔都要加入细胞，对照孔不用加入药物。
（3） 避免血清打扰。血清物质会影响吸光值，呈后尽量吸尽残余培养基。
（4） 水分保持。96孔外周一圈孔用PBS填充，减少中部孔内水分的蒸发，减少对实验的影响
（5） 防止药物与MTT反应。药物为具有氧化还原性的药物（VC、VE、谷胱甘肽等），
应先用PBS清洗细胞后，再加入MTT，否则MTT可被还原为棕褐沉淀
（6） 汽轮机技术判断污染。加入MTT个别孔内立即变为蓝黑，则可能发生污染。
原理：细胞冻存最常用的技术是液氮冷冻保存发，主要采用适当的保护剂缓慢冻存细胞。如细胞在不加入任何冻存剂的情况下直接冻存，细胞内外水分会很快形成冰晶，从而引起一系列不良反应（细胞脱水局部电解质浓度增高、PH值改变、蛋白质变性、溶酶体裂解、细胞内结构改变等、冰晶导致DNA结构改变，最终细胞死亡）。采用DMSO或甘油作为保护剂，这两种物质分子量小，溶解度大，易进入细胞，降低冰点，提高细胞对水的通透性，在慢速冷冻下使细胞内水分缓慢渗出细胞外，减少细胞内的结晶。
1、准备：、头、离心管、等放入超净台，培养基、PBS、胰酶、FBS、DMSO放入恒温水浴箱中预热
2、细胞冻存液配置：FBS：DMSO=9:1，即10%DMSO
3、收集对数生长期的细胞，在冻存前的一天最好先换液
4、加入胰酶消化细胞，制成细胞悬液，900r/min离心3min，弃去上清，将配好的细胞冻存液加入离心管中，吹打均匀后，加入1.5ml细胞悬液到冻存管中，拧紧瓶盖，封上封口胶，写上细胞种类及日期
5、将冻存管加入装有异丙醇的冻存盒中，放入-80℃过夜
6、将细胞冻存盒从-80℃中拿出，放在冰面还是那个，然后转移至液氮罐中，做好其放入的位置，登记在液氮罐使用记录本上。
注意事项：
（1）细胞冻存前应保证细胞活力好，无污染，约为80-90%的致密度
（2）冻存用进口血清，一般来说高浓度的血清有助于维持细胞活性
（3）采用进口的DMSO ，保证DMSO浓度为10%，DMSO浓度过高导致细胞毒性升高
（4）冻存复苏原则为慢冻速溶。既缓慢冻存或温度梯度降温冻存，因为DMSO进入细胞内排出水分可大限度降低细胞损伤；快速溶解复苏，是因为-10~-20℃时，细胞损伤最大，快
速溶解可帮助细胞度过这段温度。
细胞复苏
（原则：快速溶解）
1、 准备：移液、头、试管架、酒精灯、培养瓶、离心管（10ml）、封口瓶。以上物件超净台紫外照射30min
2、 培养基、PBS缓冲液，37℃下预热20min
3、 照完紫外以后，打开吹风2min
4、 从液氮瓶中取出冻存的细胞，快速放入37℃恒温水浴中，使其快速溶解1-2min。
美士灵5、 将细胞吹打均匀，然后转移至10ml离心管，加入1ml培养基，900r/min离心3min。
6、 弃去上清液，加入2ml完全培养基，用吹打均匀后，移至培养瓶，加入3ml完全培养基，上下左右摇匀，放入孵箱
7、 第二天观察细胞生长情况
细胞传代
1、准备：，头，离心管、封口胶、镊子、酒精棉球等，放置在紫外灯下照射30min后通风2min
2、PBS缓冲液、完全培养基、胰酶放置在37℃恒温水浴箱中预热3min
3、将细胞从孵箱中取出，在显微镜下观察后移至超净台
4、用移液洗掉原培养基后，加入4mlPBS缓冲液，清洗2-3次
5、弃去缓冲液，加入2ml胰酶，摇匀后，放入孵箱1.5min。
6、消化期间，夹出离心管放在试管架子上。
次火山岩7、消化后，取出培养皿，加入4ml完全培养基终止消化，用移液反复吹打，将皿壁上的细胞完全吹打下来。
8、将吹打后粘稠的细胞悬液全部吸取至10ml移液管内，封口膜封口后，900r/min离心3min
10、离心过程中，可以使用PBS缓冲液将培养皿清洗2-3次，然后加入7ml 培养基，改好盖子。
11、取出离心好的离心管，用镊子夹掉封口胶，将里面液体倒掉，但要小心不要将细胞倒掉。然后加入4ml 培养基，反复吹打均匀。
12、吸取1ml混悬液到培养皿中，十字摇匀，放置显微镜下观察是否分布均匀。然后放入孵箱。
注意事项
（1）倒液体时，瓶口应远离废液缸，防止污染
（2）加入PBS缓冲液洗涤细胞时，不要直接打到细胞面，防止细胞被冲走
（3）消化时间不宜过长
（4）吹打时，可倾斜45°瓶口，不同区域吹打4-5次。
（5）头不能触碰到别的物品。
细胞周期处理
1、准备：Rnase酶，PI染剂，PBS缓冲液、10ml离心管、水平离心机
2、样品准备：制备单细胞混悬液，并用70%预冷乙醇0-4℃固定过夜
3、样品处理：取70%预冷乙醇固定的悬液200ul，900r/min离心5min，弃去上清，悬液管底的细胞沉淀加2mlPBS缓冲液，混匀后，900r/min离心5min，弃去上清，留下约50ul，继而500ul PI染液，避光室温下染30min，4h内检测。
4、样品保存：单细胞悬液可用70%预冷乙醇固定后4℃冰箱放置1个月，或-20℃放置半年，收集完一批样品后再做。
注意事项
（1）细胞难以消化时可加入EDTA。原因是EDTA作为金属螯合剂，可以结合细胞表面的钙镁例子，使得细胞之间的粘附作用变小，消化更完全。
（2）细胞消化不可吹打过度，减少细胞碎片，尤其是固定后的细胞容易破碎
（3）用PBS洗涤离心，转速不应超过1000r/min。
（4）离心后的固定，标准做法是将细胞悬液加入到70%预冷的酒精中，而不是向细胞中加酒精，这样做可以减少细胞聚集。细胞操作过程中也应该尽可能减少细胞机械性损伤，因为机械性损伤可能造成细胞DNA丢失而影响结果准确性
（5）固定过夜的温度是4℃。固定时间必须为18h以上（过夜）
细胞凋亡（双染 AnnexinV FITC/PI）
原理：磷脂酰丝氨酸（PS）正常位于细胞膜的内侧，但在细胞凋亡早期PS可以从细胞膜内侧翻转到细胞膜外侧，暴露在细胞表面的环境中，Annexin V 是一种分子量为35-36KD的钙离子依赖性结合蛋白，能与PS 高亲和力特异性结合，将AnnexinV 进行荧光素（FITC/
PE）或Biotin标记了的Annexin V作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。
碘化丙啶（PI）是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞中，PI可以透过细胞膜，使得细胞核红染，因此将AnnexinV FITC/PI 匹配使用，就可以将凋亡早晚期细胞以及死细胞区分开来。
1、取对数生长期的细胞，25万/孔接种于6孔板
2、细胞培养24h后药物处理
3、药物处理24h后，收集旧培养基，加入1ml PBS缓冲液洗涤1次，收集洗涤液，然后加入0.5ml胰酶消化细胞，约2min后，加入1ml培养基终止消化，收集细胞悬液，2000r/min离心10min，弃去上清，用2ml 预冷后的PBS洗涤细胞1次，再2000r/min离心10min。
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