人民医院基因扩增实验室肺炎支原体核酸定量检测标准操作程序 1 项目名称
肺炎支原体核酸定量检测
2 检验方法名称
3 方法学原理
用一对肺炎支原体特异性引物和一条肺炎支原体特异性荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个荧光报告基团（R）和一个荧光淬灭基团（Q）。探针完整时，R基团发射的荧光信号被Q基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使R荧光基团和Q荧光基团分离，Q基团对R基团的抑制吸收作用消失，荧光监测系统就可接收到R基团的荧光信号。每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成。被切割产生的荧光分子数与PCR产物的数量成比例，这样就实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。因此根据PCR反应液的荧光强度即可计算出初始模板的数量。
4.1 适用标本类型：痰液、咽拭子等。
4.2 标本采集（泌尿生殖道分泌物）
a ) 痰液—使用一次性吸痰器，患儿取仰头平卧位，将吸痰管缓缓插入咽喉部，调节负压，将气管深部分泌物（在雾化吸入后效果较好）缓缓吸入储液瓶中，反复数次，储液瓶中分泌物即为标本，密封送检。
b ) 咽拭子—用咽拭子取咽部分泌物（多数会有粘稠的痰液），将咽拭子置入无菌玻璃管，密封送检。
4.3 标本保存：标本可立即用于测试，也可以保存于-20℃待测，保存期为6个月。
5 试剂
5.1 试剂名称：肺炎支原体核酸定量检测试剂盒（PCR-荧光探针法）
5.2 生产厂家：中山大学达安基因股份有限公司；
5.3 试剂货号：#DA-B064；
5.4 包装规格：尴尬青春220人份/盒；
5.5 试剂成份：
组成部分 | 数量 |
DNA提取液（500µl/管） | 2管 |
MP PCR反应液（400µl/管） | 2管 |
Taq酶（60µl/管） | 1管 |
MP阴性质控品（50µl/管） | 1管 |
MP强阳性质控品（50µl/管） | 1管 |
MP弱阳性质控品（50µl/管） | 1管 |
MP阳性定量参考品（1.0×105基因拷贝/ml）10µl/管 | 1管 |
MP阳性定量参考品（1.0×106基因拷贝/ml）10µl/管 | 1管 |
MP阳性定量参考品（1.0×107基因拷贝/ml）10µl/管 | 1宗修英管 |
MP阳性定量参考品（1.0×108基因拷贝/ml）10µl/管 | 1管 |
| |
5.6 试剂储存条件：保存于—20℃，有效期6个月。
6 仪器
ABI 7500全自动基因扩增检测仪
7 操作步骤
7.1 DNA提取
7.1.1 失踪时刻阴性质控品处理
c ) 向阴性质控品管中加入等量DNA提取液充分混匀，100℃恒温处理10±1分钟；
d ) 12000r/min离心5min，备用。
7.1.2 标本处理
7.1.2.1 痰液
e ) 痰液中加入化学学报4倍体积的生理盐水，用1ml的头反复吹打后置4℃冰箱过夜，使痰液充分液化；
f ) 用头或吸管混匀后吸取1 ml至1.5ml离心管中，12,000rpm离心5分钟；
g ) 去上清，沉淀中加入50μl DNA提取液充分混匀，100℃恒温处理10±1分钟；
h ) 12,000 rpm离心5分钟，备用。
7.1.2.2 咽拭子
i ) 向玻璃管中加入岛式唱腔1.5 ml灭菌生理盐水，充分震荡摇匀，挤干棉拭子，立即离心；或置4℃冰箱过夜；
j ) 12,000 rpm离心5分钟，沉淀加灭菌生理盐水1ml混匀，12,000rpm离心5分钟；
以下步骤同7.1.2.1步骤c、d。
7.1.3 MP弱阳性质控品处理（同阴性质控品）；
7.1.4 MP强阳性质控品处理（同阴性质控品）；
7.1.5 MP阳性定量参考品处理：8000rpm离心数秒，备用；
7.2 PCR扩增
7.2.1 试剂准备（在试剂准备区操作）：按比例（MP PCR反应液40µl/人份+ Taq酶3µl/人份）取相应量的PCR反应液及Taq酶，充分混匀后按43µl/管分装至0.2ml离心管中备用。
7.2.2 加样：向准备好试剂的0.2ml离心管中，分别加入处理后的样品（包括样本、阴性质控品、临界阳性质控品和强阳性质控品）上清液2µl，或直接加入阳性定量参考品2µl，8000rpm离心数秒，放入仪器样品槽。
7.2.3 设置PCR循环扩增程序如下
93℃ 2分钟 预变性；
93℃ 45秒 → 55℃ 60秒 10个循环
93℃ 30秒 → 55℃ 45秒 30个循环
8 结果判断：
8.1 阴性结果判定：如果增长曲线不呈S樱花舞教学型或Ct值=30，则实验结果判为样品的UU DNA总含量小于检测极限。
8.2 阳性结果判定：如果增长曲线呈S型曲线且Ct值<30，则：
k ) 若样品的Qty≤1×108，则痰液标本的MP DNA含量=Qty/4基因拷贝/ml，咽拭子标本的MP DNA含量=Qty/20基因拷贝/ml；
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