胡平静;朱振铎;李祥子
【摘 要】目的:探索阿霉素(DOX)在透析袋中释放的影响因素,获得DOX的最佳缓释条件.方法:以DOX为药物模型,通过改变透析袋的规格、缓冲介质的pH值及缓冲介质的浓度,研究不同条件下DOX的累积缓释率和缓释平衡时间,利用扫描电子显微镜(SEM)对透析袋的显微结构进行表征,利用紫外-可见分光光度计(UV-Vis)检测释放到介质中的DOX吸光度.结果:1 000 kDa透析袋的实际平均孔径约为120 nm,3 500 Da透析袋的实际孔径＜10 nm;3 500 Da透析袋中,DOX在180 min可达到释放平衡;在pH 2.0、pH5.0及pH 7.4时,0.001、0.01、0.025 mol/L PBS介质对应的DOX累积释放率分别约为70％(pH 2.0)、86 ％(pH 2.0)、98 ％(pH 2.0)、67％(pH 5.0)、76％(pH 5.0)、94％(pH 5.0)、42％(pH 7.4)、44％(pH 7.4)、75 ％(pH7.4);1 000 kDa透析袋中,DOX在160 min以内可到释放平衡;0.001、0.010、0.025 mol/L PBS介质对应的DOX累积释放率分别约为88％(pH2.0)、93％(pH 2.0)、100％(pH2.0)、84％(pH5.0)、88％(pH 5.0)、98％(pH 5.0)、32％(pH 7.4)、38％(pH 7.4)、81％ (pH 7.4).结论:一定范围内,透析袋孔径越大、缓冲介质的pH值越小、缓冲介质的浓度越大,越有利于DOX的释放.本成果对透析袋模式研究纳米药物载体的体外释药性能具有重要的理论研究及实际借鉴意义.数据管理系统
【期刊名称】《包头医学院学报》
【年(卷),期】2019(035)001
【总页数】4页(P53-55,58)
【关键词】膜;纳米结构;优化;透析袋;阿霉素
【作 者】胡平静;朱振铎;李祥子
【作者单位】皖南医学院医用材料合成应用研究所,生物活性大分子研究安徽省重点实验室,安徽芜湖241002;皖南医学院医用材料合成应用研究所,生物活性大分子研究安徽省重点实验室,安徽芜湖241002;皖南医学院医用材料合成应用研究所,生物活性大分子研究安徽省重点实验室,安徽芜湖241002;江苏大学材料科学与工程学院
【正文语种】中 文
延吉市七中随着纳米技术和生物医学的不断发展，纳米载体因具有低毒高效、靶向输药、智能释药等优点而备受人们关注[1]。其中药物控释是纳米载体的显著特征之一，其在降低药物毒副作连云港新闻综合频道
用、调整机体血药浓度、提高药物疗效等方面发挥了重要作用[2]。目前，一般采用体外模拟释药法研究纳米载体的控释性能。常见释药模式一般有直接释药法[3]、压片释药法[4]和透析袋释药法[5]。直接释药法是将荷药载体直接分散到一定体积的介质中振荡，实时监测介质中的药物含量。该法通常所需载体用量较大，且在取样测定吸光度时需进行载体分离，易造成载体损失；压片释药法是将荷药载体压制成片，然后浸入介质中振荡，实时检测载体的释药量。该法所用的片剂大小一般为10 mm×0.5 mm[6]。有研究表明，片状聚合物载体在介质中可依次通过吸水、水合、溶胀、松弛几个过程实现释药[7]。然而，压片法的载体用量相对较多，而且需要特殊的压片设备。
随着纳米释药体系研究的不断深入，透析袋释药法逐渐成为纳米载体体外释药性能研究的主流方式。该法将荷药载体封闭在商用透析袋中，然后将整个透析袋浸入一定体积的缓释介质中振荡，在固定时间检测袋外介质中的药物含量。释药测定时无需对载体进行分离，且载体用量可少至几毫克，操作方便易行，备受国内外学者的欢迎。然而，目前透析袋法研究纳米载体释药性能的实验条件却存在较大差异。就透析袋本身而言，其截留分子量通常有1 000 Da[8]、3 500 Da[9]、6 000 Da[10]、7 000 Da[11]、8 000 Da[12]、12 000 Da[13]及14 000 Da[14]等。通常透析袋的截留分子量不同，药物的透过速度也存在差别。
例如，采用8 000～14 000 Da的透析袋时，袋内阿霉素(DOX)约在5 h内可达释放平衡，其累积释放率分别为90 %(pH 5.0)和70 %(pH 7.4)，而相应条件下GO-ADH-Hep/DOX的72 h累积释放率仅约35 %和20 %[14]。若利用15 000 Da的透析袋进行释药，则发现袋内阿霉素在3 h内就可达到完全释放(pH 7.4)，而荷药的聚合物/介孔硅核壳载体的240 h累积释放率约30 %[15]。可见，透析袋的截留分子量越大，药物越容易渗出。相对于自由扩散，透析袋本身在一定程度上会阻碍药物的自由运动，这是因为透析袋内外溶液之间存在不同的“药物区域浓度”和渗透压[16]，在一定程度上会延滞载体上药物分子的释放。此外，有研究表明，介质的pH值也会影响药物的释放行为，如Zhang等[17]在透析管中研究氧化铁复合纳米粒子的释药行为时发现，在pH 6.8和pH 7.4的介质中，纯DOX在透析管中可以快速完全释放，而在pH 5.0的介质中，其释药时间发生显著延长，与DOX负载氧化铁复合纳米载体的释药时间相似。这说明介质pH值也可能影响药物在透析袋中的释放。
总的来说，影响透析袋模式体外释药行为的因素有很多，如透析袋的孔径大小、介质离子强度以及介质pH值等均可能影响载体的释药性能，而目前有关纳米载体的体外释药研究还未见专门报道。因此，在同一个实验体系下，研究纯药物在透析袋中的释放因素很有必要，以更加客观、科学地评估纳米载体的体外释药行为。
1 材料与方法
1.1 材料 盐酸阿霉素(C27H29NO11·HCl)购买于阿拉丁公司，磷酸(H3PO4)、磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H2O)、磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)等试剂均购于国药集团化学试剂有限公司，商用透析袋(3 500 Da和1 000 kDa)购于美国光谱医学。
1.2 分析测试仪器 超声仪(KQ116，昆山市超声仪器有限公司)、纯水机(DZG-303A，合肥科宁特水处理设备有限公司)、电子分析天平(FA2004N，上海菁海仪器有限公司)、酸度计(MP511，上海三信仪表厂)、水浴恒温振荡器(SHA-C，金坛市杰瑞尔电器有限公司)、紫外可见分光光度计(UV-1700，日本岛津公司)，扫描电子显微镜(SEM,Hitachi S-4800，日本岛津公司)。
1.3 透析袋表面形貌表征 剪取约2 mm×2 mm大小的透析袋，直接贴在导电胶带上，供SEM检测。
1.4 标准溶液配制及标准曲线制作 配制0.2 mol/L不同pH值(2.0、5.0、7.4)的PBS缓冲液，稀释为0.001 mol/L、0.01 mol/L、0.025 mol/L的标准缓冲液。分别以上述不同pH值和浓度
的PBS缓冲液溶解DOX，获得不同批次0.5 mg/mL的DOX标准母液。将以上不同批次母液依次稀释为5个浓度梯度，在480 nm处检测DOX溶液的吸光度，制作出对应条件下的吸光度-浓度标准曲线。
1.5 透析袋中阿霉素的释放 分别选用3 500 Da和1 000 kDa两种规格的透析袋，向其中加入2.0 mL不同批次的0.5 mg/mL DOX溶液，封闭后将整个透析袋浸入18 mL相同批次的PBS中，37 ℃恒温振荡，每隔10 min吸取6 mL袋外缓冲液，于480 nm处测其吸光度，同时补充相同体积的新鲜PBS。利用相同条件下的标准曲线计算释放出的DOX浓度，并按照下式计算DOX的累积缓释率。式中的mDOX为DOX的初始用量，V0为释放媒介的总体积，Ve为每次移取的媒介体积，Cn为第n次测量的袋外DOX浓度。
2 结果
2.1 透析袋的显微结构 为验证透析袋的实际孔道大小，通过SEM观察了3 500 Da和1 000 kDa两种规格透析袋的表面显微结构，见图1。3 500 Da透析袋的表面模糊，放大4.5万倍后也仅能看到少量裂痕，未见明显的孔洞(1a插图)，这表明3 500 Da透析袋的孔径非常小，约为几纳米。1 000 kDa透析袋表面拥有大量“蜂窝状”孔状结构，放大2.5万倍就可看
到清洗的孔口(1b插图)。经计数统计发现，1 000 kDa透析袋表面的最大孔径约为150 nm，最小孔径约为90 nm，平均孔径约为120 nm(图1c)。
图1 不同规格透析袋的SEM图a为3 500 Da,b为1 000 kDa，c为1 000 kDa透析袋孔径分布图
2.2 DOX的溶解性能 在总浓度(0.025 mol/L)保持不变的情况下，当用pH 2.0和pH 5.0的PBS配制DOX溶液时，DOX溶解较快，分别为酒红和橙红的澄清溶液(图2a、b)。而在pH 7.4的PBS溶液中，DOX溶解性相对较差，配制的溶液呈深红，经过超声分散后溶液可基本澄清，但久置后有絮状沉淀(图2c)。
图2 溶解于不同pH值PBS中的0.5 mg/mL DOX溶液a为pH 2.0，b为pH 5.0，c为pH 7.4机器人定位技术
2.3 透析袋中DOX的释放行为 当pH 2.0、180 min时，0.001、0.01、0.025 mol/L缓冲介质中DOX的累积缓释率分别为70 %、86 %和98 %，见图3a；当pH 5.0、180 min时，0.001、0.01、0.025 mol/L缓冲介质中DOX的累积缓释率分别为67 %、76 %和94 %，见图3b；当pH 7.4、180 min时，0.001、0.01、0.025 mol/L缓冲介质中DOX的累积缓释率分别为42 %、44 %和75 %，见图3c。
颜面除皱
采用相同方法，以1 000 kDa的透析袋研究DOX的释放行为。3种pH值下，DOX约在160 min内达到释放平衡，其中pH 2.0时释放平衡时间约为100 min。当pH 2.0、160 min时，0.001、0.01、0.025 mol/L缓冲介质中DOX的累积缓释率分别为88 %、93 %和100 %，见图4a；当pH 5.0、160 min时，0.001、0.01、0.025 mol/L缓冲介质中DOX的累积缓释率分别为84 %、88 %和98 %，见图4b；当pH 7.4、160 min时，0.001、0.01、0.025 mol/L缓冲介质中DOX的累积缓释率分别为32 %、38 %和81 %，见图4c。
图3 3 500 Da透析袋内阿霉素在不同pH和不同浓度PBS中的缓释曲线a为pH 2.0、b为pH 5.0、c为pH 7.4
图4 1 000 kDa透析袋内阿霉素在不同浓度和pH PBS中的缓释曲线a为pH 2.0，b为pH 5.0，c为pH 7.4
3 讨论
3.1 透析袋的显微结构 对于透析袋而言，通过截留分子量可以估算其孔径大小，一般截留分子量越大，孔径越大。3 500 Da透析袋为典型的透析膜，其理论孔径一般为几纳米，通
过SEM检测时孔洞难以看清。这种孔径可允许大多数药物分子透过，并可有效阻止一般纳米载体的通过，故常用于纳米载体的体外释药研究[9]。但这种孔径可能会对药物分子的渗出产生一定的延滞，进而影响纳米载体释药性能的客观评估。1 000 kDa透析袋接近微滤膜的孔径大小，其理论孔径一般超过100 nm，与SEM的实际检测结果一致。这种孔径更有利于药物分子的通过，并可有效阻止较大尺寸纳米载体的通过，因而可用于尺寸较大纳米载体的体外释药研究。
3.2 DOX的溶解性能 为选择更有利于负载的DOX溶液，实验对不同pH值PBS中的DOX溶解度进行了比较。结果表明，DOX的溶解性受到溶液pH的影响，一般pH越低，溶解性越大，但酸性太大又不利于纳米载体对DOX的负载。如Wang等[18]合成出β环糊精修饰的磁性石墨烯纳米复合物，研究了该复合物在pH 2.0、pH 3.0、pH 4.0、pH 5.0、pH 6.0、pH 7.0、pH 8.0时的DOX负载，结果发现，随着pH的不断增大，DOX的负载容量先升高再下降，pH为7.0时，DOX负载率达到最大，约为72 %。Chang等[19]合成出聚合物包覆的磁性介孔硅纳米粒子，在pH 5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0下研究了该纳米粒子对DOX的负载，发现随pH的不断增大，载体对DOX的负载率也从31.8 %逐渐升高到38.2 %。可见，以DOX为药物模型时，一般在中性条件下可获得更高的负载效率。
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