摘要:目的
体外评价带有叶酸和穿膜肽双配体的、负载紫杉醇纳米药物输送系统的生物性能。方法
分别用小分子紫杉醇和双配体紫杉醇纳米粒孵育MDA-MB-231细胞及A549细胞,24
h后利用MTT法测定各组细胞的相对存活率。采用SPSS13.0统计分析软件进行统计学分析,所有数据均以ˉ x
s表示。结果24h后MDA-MB-231细胞及
A549细胞的相对存活率均为小分子紫杉醇组>
双配体紫杉醇纳米粒组(P<0.05)。结论
叶酸的靶向作用与穿膜肽的穿膜作用能够协同提高药物在靶细胞的聚集,进一步增强药物输送系统的作用,为开发新型、高效药物输送系统提供基础。关键词:紫杉醇;叶酸;纳米药物输送系统Abstract:Objective
To
evaluate
in
vitro
biological
activities
of
paclitaxel
nanoparticles
with
dual
ligands.Methods
The
cells
were
incubated
with
free
paclitaxel
or
H-F-Tat-P
NPs,and
then
evaluated
by
MTT
method.Results
The
results
of
cell
viability
for
both
two
cell
lines
were:free
paclitaxel
>
H-F-Tat-P
NPs.(P<0.05).Conclusion The
strategy
on
nanomedicine
with
dual
ligands
can
enhance
the
cellular
uptake
of
drug
thereby
improving
promising
its
chemotherapeutic
efficiency.The
nanoparticle
system
could
be
used
as
a
pro mising
cancer
cell
specific
delivery
system
for
further
investigation
.
Key
words:folate;paclitaxel;nanoparticle
system
细胞穿膜肽又称蛋白转导域,是一类由少于30个氨基酸组成的多聚阳离子短肽片段,可以携带比其分子量大100倍的外源性大分子物质进入细胞内,且对宿主细胞无显著毒副作用[1-2]。Tat(transactivating
transcriptional
activator
peptide)是目前研究最多、应用最广泛的穿膜肽[3-4]。由于细胞穿膜肽无靶向性而限制了它的在体应用[5]。叶酸是天然存在的小分子物质,几乎无免疫原性,且叶酸受体在大部分恶性肿瘤组织,比如乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌等组织中高度表达,而在正常组织中几乎不表达[6-7]。因此,叶酸作为抗肿瘤药物输送系统的靶向配体具有良好的理论基础和广泛的应用前景。
结合前期已经成功制备了负载紫杉醇的双配体纳米药物输送系统(Heparin-Folate-Tat-Paclitaxel
Nanoparticles,H-F-Tat-P
NPs)[8],本文我们体外评价该系统的生物性能,为进一步研究其体内生物活性,特别是开发具有高效作用的药物输送系统提供基础。
1 材料与方法
1.1材料与仪器
导电复合材料1.1.1
材料
人乳腺癌细胞MDA-MB-231、人肺癌细胞A549(南方医院肿瘤研究所保存);RPMI
1640细胞培养基、新生牛血清、0.25%胰蛋白酶、胎牛血清、L-15细胞培养基(广州速研生物科技有限公司);3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)(Sigma,America);氯化钠(NaCl)、十二水合磷酸二钠(Na2HPO4·12H2O)、氯化钾(KCl)、磷酸二氢钾(KH2PO4)(广州铭旺生物科技有限公司);二甲基亚砜(DMSO,Sigma,America)。
1.1.2
仪器设备
细胞计数板、细胞培养皿、载玻片、盖玻片、移液器头、离心管、EP管、6孔板(广州杰特伟公司),1000μL微量加样×1支、20-100μL微量加样×1支、1-20μL微量加样×1支(法国吉而森公司),CP225D电子分析天平(Sartorius,Germany),电热恒温水浴锅(北京市永光明医疗仪器厂),MWK酶标仪(Labsystern,Multiskan,Ascent,Finland),低速离心机(LD5-2A),LRH-150-S型恒温恒湿培养箱(广东省医疗器械厂)。
1.2
参照前期制备方法[8]制备双配体紫杉醇纳米粒。
1.3
MTT法测定细胞相对存活率
纳达尔资料 (1)细胞培养:人乳腺癌细胞MDA-MB-231、人肺癌细胞A549置于37℃,5%
CO2、饱和湿度恒温的细胞培养箱中培养,培养液分别为L-15、RPMI
1640,均含10%FBS、100
U/mL青霉素、100
U/mL链霉素。每天更换培养液一次。
(2)铺板:将人乳腺癌细胞MDA-MB-231、人肺癌细胞A549分别接种于6孔板内,每孔约2.5
×
105个细胞,置37℃,5%CO2、饱和湿度培养箱中培养,定期观察细胞生长情况。
(3)上样:设置小分子紫杉醇组、双配体紫杉醇纳米粒组,每组分4个浓度梯度,即9
μg/mL,18
μg/mL,36
μg/mL,54
μg/mL。置37℃,5%CO2、饱和湿度培养箱中培养4
h后将细胞接种至96孔板,继续培养20
h。
(4)呈:20
h后取出96孔板,每孔加5
mg/mL
MTT溶液25
μL,孵育4
h后终止培养,小心吸弃孔内细胞培养上清液,每孔加入150
μL
DMSO,振荡10
min,使结晶物充分溶解。
(5)比:选择570
nm波长,在酶标仪上测定各孔吸光率值(OD值),记录结果,求得同一条件下各孔的吸光率均值,计算细胞相对存活率,细胞相对存活率(%)=(实验
十一五组OD均值/对照组OD均值)×100%。
(6)统计学分析:采用SPSS13.0统计分析软件进行统计学分析,所有数据均以
s表示。小分子紫杉醇、双配体紫杉醇纳米粒的毒性作用比较均采用One-Way
ANOVA,方差不齐则选用近似F检验Welch法进行方差分析,差异性检验水准设为p<0.05(双侧)。
2
结果
分别用小分子紫杉醇、双配体紫杉醇纳米粒处理MDA-MB-231细胞和
A549细胞后孵育24小时,由图1可以看出,双配体紫杉醇纳米粒对MDA-MB-231细胞的抑制作用(IC50
45.8
μg/mL)明显好于小分子紫杉醇,说明叶酸靶向作用与穿膜肽的穿膜作用在抑制细胞活性方面起着关键的作用。在一定浓度范围内,双配体紫杉醇纳米粒对A549细胞的抑制作用(IC50
50.3
μg/mL)亦好于小分子紫杉醇,这可能是由Tat的穿膜作用所致。双配体紫杉醇纳米粒对MDA-MB-231细胞的抑制作用高于A549细胞则可能归因于叶酸的靶向作用。
a
b
图1分别用小分子紫杉醇()、双配体紫杉醇纳米粒()处理MDA-MB-231细胞(a)
及
A549细胞(b),24小时后用MTT法测定细胞相对存活率。两种细胞相对存活率均为小分子紫杉醇>双配体紫杉醇纳米粒,差异具有统计学意义(*
P
<
0.05)
3
讨论
本研究选用叶酸受体表达阳性的乳腺癌细胞MDA-MB-231和叶酸受体表达阴性的肺癌细胞A549来评估负载紫杉醇的双配体纳米药物输送系统的生物性能。用MTT法测定细胞在不同条件(小分子紫杉醇、双配体紫杉醇纳米粒)下的相对存活率。结果示双配体紫杉醇纳米粒对MDA-MB-231细胞的抑制作用(IC50
45.8
μg/mL)明显好于小分子紫杉醇,说明叶酸靶向作用与穿膜肽的穿膜作用在抑制细胞活性方面起着关键的作用。在一定浓度范围内,双配体紫杉醇纳米粒对A549细胞的抑制作用(IC50
50.3
μg/mL)亦好于小分子紫杉醇,提示Tat可能促进细胞对纳米粒的摄取。双配体紫杉醇纳米粒对MDA-MB-231细胞的抑制作用好于A549细胞则可能归因于叶酸的靶向作用。
叶酸和穿膜肽共同修饰的纳米药物输送体系,能够协同促进肿瘤细胞对载药纳米粒的摄取,提高肿瘤细胞内药物浓度,从而有效抑制肿瘤细胞生长,其抑瘤效果优于单配体修饰的纳米药物输送系统,这为进一步体内实验打下基础。深水区
参考文献:
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作者简介:周兵(1985-),男,医师,湖南衡阳人,硕士,研究方向:妇科肿瘤的防治
通讯作者:张霞,女,主治医师,硕士,研究方向:分子影像学。