宋佳伦;王心正;吴瑾;李爱玲;满江红
【摘 要】黑海番鸭HMOX1 (Heme Oxygenase 1) belongs to the family of heme oxygenase,which is the essential enzyme in heme catabolism and is highly expressed in malignant gliomas.Glioma stem ceils (GSCs) are a small population of tumor cells,with the ability of unlimited proliferation,self-renewal and differentiation.GSCs are considered to be the causes of tumor initiation,recurrence and metastasis.In this study,we performed a mass spectrometry screen and found that HMOX1 was specifically induced in GSC under hypoxia.To our knowledge,there is no report on the function of HMOX1 in GSCs under hypoxic environment.To study whether HMOX1 was involved in GSCs regulation under hypoxia,we knocked down HMOX1 expression in GSC by using lentivirus system,and then cultured GSCs in 1％ O2 condition.The knock-down effect was examined by Western Blot and the cell phenotype was investigated by tumor sphere formation experiment.Our results showed that knocking down HMOX1 significantly inhibited GSC cell viability and tumor sph宛如英雄
ere formation.Altogether,our studies suggested that HMOX1 is preferentially induced in GSCs under hypoxia and plays critical roles in GSC maintenance under the hypoxic condition.%HMOX1(Heine Oxygenase 1)属于血红素加氧酶家族,作为血红素分解代谢中的必须酶,在恶性胶质瘤中高表达.脑胶质瘤干细胞(Glioma Stem Cell,GSC)是胶质瘤中的一小肿瘤细胞,具有无限增殖、自我更新、多向分化的能力,被认为是肿瘤发生、复发、转移的根源.本实验通过质谱筛选,发现HMOX1特异性在胶质瘤干细胞中被低氧诱导高表达.目前关于HMOX1蛋白与缺氧环境下GSC的功能相关性未见文献报道.为了研究HMOX1是否在低氧时对GSC有调控作用,我们用慢病毒感染体系在GSC中敲低HMOX1表达,接着对细胞进行1％ O2低氧培养,用Western Blot检测基因干涉效果,用Tumor Sphere形成实验观察GSC细胞表型.实验结果表明,在低氧条件下干涉GSC中HMOX1基因的表达对GSC的生长及存活有明显的抑制.综上所述,HMOX1在GSC中特异性被低氧诱导高表达,且对GSC的生长存活具有调控作用,提示HMOX1有可能是GSC在低氧微环境中的重要调控因子.
【期刊名称】《科学技术与工程》
【年(卷),期】2017(017)031
褐变度综合自动化
【总页数】6页(P193-198)
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【关键词】HMOX1;胶质瘤干细胞;低氧;Tumor Sphere
【作 者】宋佳伦;王心正;吴瑾;李爱玲;满江红
【作者单位】军事医学科学院生物医学分析中心,北京100850;军事医学科学院生物医学分析中心,北京100850;军事医学科学院生物医学分析中心,北京100850;军事医学科学院生物医学分析中心,北京100850;军事医学科学院生物医学分析中心,北京100850
【正文语种】中 文
【中图分类】Q28
胶质母细胞瘤(Glioblastoma，GBM)是成人中最常见的原发性脑肿瘤，是最致命和最难治的实体瘤之一[1]。GBM在临床上可分为Proneural、Neural、Classical 和Mesenchymal 4种分子分型。尽管GBM目前在临床上使用多种模式联合(包括手术切除，联合放疗和化疗)，患者的中位生存期仅为12～15个月[2]。目前已有报道证明胶质瘤干细胞(Glio
ma Stem Cell，GSC)对放射和化疗具有相对较强的抗性，是GBM患者复发和死亡的主要原因之一。GSC还通过刺激血管生成来促进肿瘤生长，是目前胶质母细胞瘤临床的潜在靶标[3]。GSC经常在胶质瘤中的缺氧区聚集，有实验表明缺氧可以维持GSC的生存和诱导GSC的扩增[4,5]。因此在缺氧条件下研究GSC的调控方式对胶质瘤的有指导意义。
HMOX1(Heme Oxygenase 1)属于血红素加氧酶家族，是血红素分解代谢中的必须酶，负责将游离血红素降解为一氧化碳(CO)和铁，其进一步转化为铁蛋白(铁螯合蛋白)和胆绿素，胆绿素随后转化为胆红素[6]。目前研究认为，HMOX1可被多种刺激诱导，特别是氧化应激[7,8]。HMOX1由于其抗氧化和抗细胞凋亡作用而在肿瘤快速生长中具有重要作用。HMOX1在胶质瘤组织中高度表达，是人胶质瘤新生血管形成的标志物之一[9]。然而，HMOX1在胶质瘤干细胞中的表达以及功能目前未见报道。
本实验通过质谱筛选发现HMOX1可以特异性地在胶质瘤干细胞中被低氧诱导高表达。为了进一步确定HMOX1在低氧条件下是否在GSC的生长存活过程中发挥作用，利用shRNA干涉技术构建稳定敲低HMOX1表达的GSC细胞系，并将细胞进行低氧诱导。结果表明，在
低氧条件下，敲低HMOX1的表达显著抑制GSC的Tumor Sphere形成，提示HMOX1在GSC低氧环境中的生长及存活等方面起调控作用。
含氨苄抗性的pLKO1.1慢病毒载体(addgene)，磷酸钙转染试剂(迈晨科技有限公司)，限制性核酸内切酶Age Ⅰ，EcoR Ⅰ，T4连接酶(New England Biolabs公司)，DNA回收试剂盒(Promega公司)，质粒提取试剂盒(Promega公司)，DMEM培养基(迈晨科技有限公司)，Neurobasal® Medium培养基(Gibco公司)，Cell Viability Assay 试剂盒(Promega公司)。 人胶质瘤干细胞细胞株4121、456、387、H2S，人胚肾细胞293FT(获赠于美国克利夫兰医学中心，Cleveland Clinic，Jeremy Rich实验室)。
恒温培养箱(Thermo公司)，低氧培养箱(Binder公司)，核酸电泳仪(Amer-sham公司)，细胞计数仪(Bio-Rad公司)，恒温摇床(智诚分析仪器制造有限公司)，蛋白电泳设备(Bio-Rad公司)，共聚焦显微镜(Bio-Rad公司)，金属浴(北京金银杏生物科技有限公司)，PCR仪(Biometra公司)，水浴锅(北京长凤仪器仪表公司)。
将4株GSC 4121、456、387、H2S分别接种于10 cm皿中，细胞个数为1.5×106个，每一
株GSC 接种两个10 cm皿，用10 mL Neurobasal® Medium培养基重悬细胞。分别将其中1皿GSC放入低氧培养箱，在1% O2浓度下，37 ℃培养48 h。另外一皿GSC在常氧条件下培养48 h。收细胞后用Western Blot检测各株细胞中的HMOX1是否可被低氧诱导。
查GPP Web网站，选择适用于pLKO.1慢病毒载体且针对HMOX1基因得分高的shRNA干涉序列，如表1所示。
将合成好的HMOX1的shRNA引物稀释至10 μmol/L后，将互补的shRNA单链序列各5 μL置于1.5 mL EP管中，再加24 μL水、6 μL浓度为0.5 mol/L的NaCl溶液后混匀。将此混合体系置于水浴锅中，95 ℃水浴10 min，关闭水浴锅，让其温度缓慢降至室温。将3 μg的pLKO.1慢病毒载体加入1.5 mL EP管，加入限制性核酸内切酶Age Ⅰ，EcoR Ⅰ各2 μL，Fast Digest Buffer 5 μL，最后加水配成50 μL酶切体系，混匀后在37 ℃金属浴上酶切2 h。对酶切后的样品进行核酸凝胶电泳，对酶切成功的载体条带用胶回收试剂盒进行回收。取退火后的引物片段3 μL置于0.6 mL EP管，加入酶切好的载体1 μL、T4连接酶1 μL、T4连接酶Buffer 1 μL，最后加水配成10 μL连接体系，混匀后置于22 ℃金属浴上1.5 h。取5 μL连接后的体系置于1.5 mL EP管，加50 μL DH5α感受态细胞后混匀，冰上放置30 min后，在42
℃水浴锅中热激90 s，快速放回冰上冷却2 min，加入600 μL无抗的LB培养基，在恒温摇床上37 ℃培养1 h。摇床培养后的菌液3 000 r/min离心3 min，弃掉大部分上清，留下80 μL左右菌液，将其均匀涂于含氨苄抗性的LB平板上，置于37 ℃的恒温孵箱中培养14 h。平板长出菌后，挑取单克隆，与10 μL水在0.6 mL EP管中混匀，吸取1 μL菌液加入新的0.6 mL EP管，并加入菌液鉴定的引物单链各1 μL、水7 μL、2×Mix 10 μL后混合均匀，配成20 μL的反应体系，用PCR仪进行扩增。之后进行核酸凝胶电泳鉴定阳性克隆。菌落鉴定为阳性克隆后，将剩余的9 μL菌液接种到装有5 mL氨苄抗性的LB培养基的螺旋管中，37 ℃恒温摇床上培养14 h，收菌液用质粒提取试剂盒提取质粒。将构建好的shHMOX1慢病毒质粒送公司测序。
将293FT细胞接种于10 cm皿，每皿接种2.5×106个细胞，共接种3皿。当293FT细胞密度达到30%左右时，用磷酸钙转染法将慢病毒包装质粒PAX2 5 μg、VSVG 5 μg以及构建成功的shHMOX1慢病毒质粒或sh-NT质粒5 μg共转染到293FT细胞中。6 h之后将DMEM培养基换为Neurobasal® Medium培养基。72 h之后，将培养基上清收集到15 mL离心管中，3 000 r/min离心3 min，将上清转移至新的15 mL离心管，保存在-80 ℃。
将GSC 4121接种于10 cm皿中，每皿细胞个数为1.5×106个，共接种3皿，分别用4.5 mL Neurobasal® Medium培养基重悬后，加入4.5 mL的病毒上清夜，混匀，放于37 ℃恒温孵箱中培养48 h。
将感染病毒的细胞消化，用台盼蓝染后计活细胞个数，之后将HMOX1干涉组和sh-NT对照组的细胞都接种到96孔板，每孔接种2 000个细胞，用200 μL培养基重悬，每组接种3个复孔，共接种4个孔板。将3个接种完成的96孔板放入低氧培养箱，在1% O2浓度下培养，剩余的一个96孔板用Cell Viability Assay试剂盒检测干涉组和对照组的细胞活力，其结果记为0 d时的细胞活力。在96孔板开始培养的1 d、3 d、5 d后，分别将低氧条件下培养的一个96孔板用Cell Viability Assay试剂盒测定其干涉组和对照组细胞活力，其结果记为1 d、3 d、5 d时的细胞活力。第5 d检测细胞活力前，用共聚焦显微镜的成像系统对孔板内的Tumor Sphere形成情况进行拍摄，并对孔板中的Tumor Sphere个数进行统计。
将接种96孔板后剩余细胞分别接种到10 cm皿中，用10 mL Neurobasal® Medium培养基重悬，放入低氧培养箱，在1% O2浓度下，37 ℃培养48 h后，收细胞并用Western Blot检测干涉效果。
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