HPLC-ELSD 法测定黄芪多糖中单的糖组成及摩尔比
陈卫平陈琴鸣刘斌
（丽水市食品药品检验所，浙江丽水323000）恳谈会
摘要目的：用HPLC-ELSD测定黄芪中多糖单糖组成及摩尔比测定。方法：采用Agilent XDB-C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，柱温25 ℃；流动相为乙腈-水（80：20），流速0.8 mL·min-1；漂移管温度83.5 ℃，载气（N2）流速2.2L·min-1。结果：鼠李糖（Rha ）Y=1.3583x+5.2624, r = 0.9992, 线性范围：0.1634～1.634μg、阿拉伯糖（Ara）Y=1.2533x+3.9617, r = 0.9992 线性范围：0.3818～3.8176μg、木糖（Xyl ）Y=1.3051x+5.7616 r = 0.9994 线性范围：0.1681～1.681μg、甘露糖（Man）Y=1.1817x+4.8772 r = 0.9918 线性范围：0.1604～1.604μg、半乳糖（Gal）Y=1.2622x+4.9182 r = 0.9952 线性范围： 0.1634～1.634μg、葡萄糖（Glc）Y=1.3181x+7.4172 r = 0.9994 线性范围：0.1604～1.604μg、葡萄糖醛酸（Glc A）Y=1.2661X+0.2196 r = 0.9967 线性范围：11.64～116.4μg各个范围内呈良好的线性关系, 摩尔比Glu A :Rha: Ara: Gal: Glc 25.4∶0.03∶0.07∶0.08∶1。结论：本方法灵敏、简便、准确。
关键词：HPLC-ELSD；黄芪多糖；单糖组成；摩尔比；鼠李糖、阿拉伯糖、木
糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖、葡萄糖醛酸
黄芪为豆科植物膜荚黄芪[Astragalus membranaceus(Fisch.) Bge.]或蒙古黄芪[Astragalus membranaceus (Fisch.)Bge. var. mongholicus(Bge.)Hsiao] ，具补中益
气、升阳固表、托毒生肌、利水退肿之功[1]。黄芪多糖是黄芪的有效成分之一，
现代药理学研究表明，具有抗衰老、抗过氧化、促进免疫功能活性、改善心血管
功能[2]、抗肿瘤等作用[ 3 ]。临床常用作免疫增强剂。
多糖中的单糖组成测定是控制多糖质量和提供多糖基本信息的最重要环节。
因单糖存在互变异构体、差向异构体、结构相似等特征，而且往往同一待测样品，
可能含有许多类型的单糖。所以，必须具有高效的分离技术，方可实现系列单糖 的有效分离。
单糖组分的谱分离测定方法目前主要有高效液相谱法(HPLC)、气相
谱法(GC)、薄层谱法(TLC)等。各种液相谱柱以及检测器的出现给液相谱
在单糖测定分析带来了新的方法。本实验重点对非衍生化HPLC法测定单糖方法
学进行了研究。本方法用HPLC-ELSD 法测定黄芪中单糖组成及摩尔比灵敏、
简便、准确。
1仪器与试药
Agilent 1100 高效液相谱仪（美国，安捷伦公司）；Alltech-2000ES型蒸发光散射检测器（美国，奥泰科技公司）。乙腈、甲醇为谱纯，纯净水，其余试剂为分析纯；鼠李糖（Rha）、阿拉伯糖(Ara)、木糖(Xyl)、甘露糖(Man)、半乳糖(Gal)、葡萄糖(Glc) 、葡萄糖醛酸(Glc A)，均购自上海楷洋生物技术有限公司，含量≥99.0%。黄芪粗多糖（APS）：20060701，浙江维康药业有限公司提供。2方法与结果
2.1 黄芪多糖的分离纯化
根据文献[4]制备，方法如下：取黄芪50g，研成细粉，加水300mL煎煮三次，第一次3h，第二、三次各2 h，合并煎液，滤过，滤液减压浓缩至（60～70℃，-0.08Mpa）相对密度1.10～1.15的清膏，加乙醇使含醇量达80％，静置冷藏24h，滤过，取沉淀于60℃干燥，得APS约为3 g。
2.1.1 脱素
取APS 10 g，加热水400 mL，微热使完全溶解，加氨水调pH 7.8，有沉淀生成，至滴加氨水不再产生沉淀，此时溶液pH维持在7.8，将溶液于4000 rpm 离心10 min，取上清液加30% H2O2 60 mL(糖溶液的15%)，于50 ℃水浴锅中保温3h，溶液由棕褐变为淡黄半透明溶液，放冷到室温，离心除去沉淀。烫吸
2.1.2去蛋白
上海健身房阉割取脱后的多糖溶液，在水浴中搅拌的情况下缓缓加入等体积的10%的三氯醋酸溶液（TCA），置于冰箱内过夜，离心，除去沉淀即得无蛋白质的多糖提取液。
家有学子
浙江海洋学院学报2.1.3 醇沉、脱水干燥
将脱去蛋白后的多糖溶液，经透析后，置于旋转蒸发仪中减压浓缩到四分之一体积，缓缓加入5倍体积的无水乙醇，放置冰箱中过夜，经4号砂芯漏斗过滤，沉淀依次用无水乙醇、丙酮洗涤3次，真空干燥，得多糖精制品（APS I），称重，计算得率。
2.2单糖对照溶液的制备
精密取各单糖对照品适量，用水制成1mg/mL的对照品储备溶液。
精密吸取各个储备液2 mL置25mL量瓶中，用水定容，摇匀，作为对照品
溶液。
精密吸取各个储备液2 mL，置同一量瓶中，用水定容，摇匀，作为混合对照品溶液（试验中根据需要，对照品数量、体积可有所不同）。
2.3谱柱的选择
据文献[5]研究，用于单糖测定的谱柱有糖柱、氨基柱、腈基柱和HILIC 柱(亲水作用谱柱)，但以糖柱较佳，经比较分析，选购Alltech 公司的prevail carbohydrate ES (250×4.6 mm, 5 μm)进行试验，流动相采用CH3CN∶H2O = 85∶15。
根据不同的混合溶液试验，糖柱能对Glc A、Rha、Ara、Xyl、Man、Gal、Glc 7个单糖达到较为理想的分离效果，但Glc A与溶剂峰较接近，且原来也估计无醛酸类，因此谱条件考察时多采用了另外6种单糖。除Glc A外6种单糖对照溶液的HPLC谱峰见图1。
图1：采用糖柱分离6个单糖对照品混合溶液的HPLC图谱
(1-Rha 2-Ara 3- Xyl 4-Man 5-Gal 6-Glc ) 结果表明，采用氨基、腈基柱，对混合对照品溶液进行了分析，但无法完全分离各单糖，分离效果不如糖柱，其谱图见图4。
图2：采用氨基柱分离6个单糖对照品混合溶液的HPLC图谱
而HILIC柱对混合糖溶液进行分析，有裂峰出现，有8个峰，不能确定是哪个对照品峰，且各个谱峰的分离度很差，单独测定单糖对照品溶液（GLc、Man、Xyl 、Ara）也都出现裂峰。经对柱重新清洗后，改用水为流动相，结果仍不佳。其谱图分别见图3、4。
图3：采用HILIC柱分离6个单糖对照品混合溶液的HPLC图谱
图4：采用柱HILIC柱分析Glc的HPLC图谱
根据以上试验结果，本研究其它分析均以糖柱进行试验，结合样品水解后TLC分析和HPLC初步分析情况，方法学试验采用分离较好、且GYJN I 所含的Glc A、Rha、Ara、Xyl、Man、Gal、Glc 等单糖
进行。
2.4 流动相与流速的选择
单糖测定多采用乙腈-水混合流动相，乙腈含量对糖分离和保留时间都有一定的影响, 当CH3CN∶H2O ≤65∶35 时, 不利于单糖分离, 但便于多糖分离。乙腈含量在一定范围里增大, 各单糖出峰时间均提前, 分离度也相应增加。
分别对75 %、80 %、85 % 3 种不同的乙腈含量试验，80 %的乙腈和85 %的乙腈测定均能得到较为理想的分离效果，当选用75%的乙腈含量时, 多糖的分离效果变差。根据各单糖的分离效果和保留时间等情况综合考虑，选择最佳的乙腈含量是80 %。不同流动相分析6种单糖对照品混合溶液的谱图见图5。
张静江
图5：6个单糖对照品混合溶液的HPLC谱图
（Colum: prevail carbohydrate; mobile phase: CH3CN∶H2O: A- 80∶20, B- 85∶15, C- 75∶25, flow rate: 0.8 mL/min）
为得到更佳的分离效果，以上述条件，对不同流速（0.6、0.8、1 mL/min）进行了考察，结果以0.8 mL/min较佳。
因此确定谱条件为：谱柱：prevail carbohydrate ES柱；流动相：CH3CN∶H2O=80∶20；流速：0.8 mL/min。
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