基于抵当汤减毒的钩吻生物碱体内外含量变化研究 王文义，檀兴慧，王婉莹，谌赛男，廖华军，吴水生，李德森 福建中医药大学药学院，福建福州 350122
摘要：目的 建立体内、体外钩吻生物碱成分测定方法，并测定抵当汤减毒前后钩吻生物碱成分含量，探讨抵当汤减缓钩吻毒性的可能作用机制。方法 采用UPLC-QDa体外检测钩吻与抵当汤混合前后6种生物碱成分变化，采用UPLC-MS/MS检测抵当汤联合钩吻灌胃对小鼠血浆中钩吻生物碱成分含量的影响。结果 与抵当汤混合后，钩吻中钩吻素子、钩吻素甲、钩吻绿碱、胡蔓藤碱乙含量明显降低（P＜0.01）；抵当汤＋钩吻组小鼠血清钩吻素子、钩吻素甲、钩吻素己、钩吻绿碱、胡蔓藤碱乙、胡蔓藤碱丙含量均较钩吻组明显降低（P＜0.01）。结论 降低钩吻素子、钩吻素甲、钩吻素己、钩吻绿碱及胡蔓藤碱乙含量可能是抵当汤减缓钩吻毒性的作用机制之一。 关键词：抵当汤；钩吻总碱；UPLC-QDa；UPLC-MS/MS；含量变化
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304(2021)01-0100-07
DOI：10.19879/jki.1005-5304.202004096 开放科学（资源服务）标识码（OSID）：Study on Changes of Chemical Composition of Alkaloids of Gelsemium elegans
Based on Didang Decoction after Reducing Toxicity
WANG Wenyi, TAN Xinghui, WANG Wanying, CHEN Sainan, LIAO Huajun, WU Shuisheng, LI Desen School of Pharmacy, Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350122, China Abstract:Objective To establish a method for determination of alkaloids of Gelsemium elegans in vitro and in vivo; and to study the content of alkaloid components of Gelsemium elegans before and after reducing toxicity; To explore the possible mechanism of the action of Didang Decoction in the process of reducing toxicity. Methods UPLC-QDa method was used to detect the changes of 6 alkaloids after combined use of Gelsemium elegans and Didang Decoction in vitro. UPLC-MS/MS method was established to detect the changes of plasma alkaloids in mice fed with Gelsemium elegans combined with Didang Decoction. Results The contents of koumine, gelsemine, gelsevirine and humantenine of Gelsemium elegans were signifantly decreased under the action of Didang Decoction (P<0.01). The contents of koumine, gelsemine, gelsenicine, gelsevirine, humantenine and humantenidine in group of Didang Decoction+ Gelsemium elegans were significantly decreased compared with Gelsemium elegans group (P<0.01). Conclusion The decrease of koumine, gelsemine, gelsenicine, gelsevirine and humantenine of Gelsemium elegans may be one of the mechanisms of Didang Decoction to reduce the toxicity of Gelsemium elegans.
Keywords:Didang Decoction; alkaloids of Gelsemium elegans; UPLC-QDa; UPLC-MS/MS; changes in content
抵当汤出自《伤寒论》，由水蛭、大黄、桃仁、虻虫组成，临床多用于太阳蓄血证。研究表明，抵当汤具有一定的抗肿瘤及解毒功效[1-4]。钩吻Gelsemium elegans又名大茶药、断肠草、野葛、胡蔓藤等，为马钱科胡蔓藤属植物[5]，钩吻生物碱是钩吻的主要药效物质，现代研究主要涉及钩吻素子、钩吻素甲、钩吻素己、钩吻绿碱、胡蔓藤碱乙、胡蔓藤碱
基金项目：福建省自然科学基金（2019J01342）；福建中医药大学科研平台校管课题（X2019008-平台）
通讯作者：李德森，E-mail：***************丙6种生物碱。钩吻素子、钩吻绿碱、胡蔓藤碱乙均有报道与抗肿瘤[6]及镇痛、抗炎、散瞳及增强免疫力[7-11]相关，钩吻素己为主要毒性成分。钩吻量与中毒量接近，导致临床应用困难。
中医药具有发酵[12]、炮制[13]、配伍[14]、“方证相关”[15]等多种减毒存效方法，能使有毒药物安全用于临床。立足于“方证相关”减毒理论，辨证应用抵当汤可降低钩吻毒性。有研究显示，抵当汤联合钩吻应用后中毒小鼠的存活时间显著延长，小鼠肺泡腔渗出减少，肺组织局灶性实变消失[15]，表明抵当汤对钩吻中毒具有良好的解毒作用，但对于抵当汤减钩吻毒的
具体作用机制尚不清晰。
基于本课题组前期研究，本研究进一步探讨抵当汤减缓钩吻毒性前后体内外钩吻生物碱化学成分的变化。采用UPLC-QDa对钩吻与抵当汤混合前后生物碱成分的变化进行检测，并通过UPLC-MS/MS检测抵当汤联合钩吻灌胃前后小鼠血浆钩吻生物碱成分的含量变化，旨在揭示抵当汤减缓钩吻毒性的物质基础，为钩吻在中医理论指导下的临床合理应用提供实验基础。
1 仪器、试药与动物
H-class型超高效液相谱仪、ACQUITY QDa型质谱仪，美国Waters公司；LC1260型高效液相谱仪，美国Agilent公司；GT-2120QTS型智能超声波清洗机，广东固特超声股份有限公司；AR223CN型十万分之一电子天平，奥豪斯仪器（上海）有限公司。
钩吻采自福建省龙岩市胡蔓藤种植基地，抵当汤饮片（大黄、水蛭、虻虫、桃仁）购自福建中医药大学国医堂医院，经福建中医药大学黄泽豪副教授鉴定，钩吻为马钱科胡蔓藤属植物钩吻Gelsemium elegans Benth.的干燥茎，大黄为蓼科植物掌叶大黄Rheum palmatum L.的干燥根及根茎，水蛭为水蛭科动物柳叶蚂蟥Whitmania acranulata Whitman的干燥全体，虻虫为虻科昆虫华虻Aabanas mandarinus的干燥全体，桃仁为蔷薇科植物桃Prunus persica（L.）Batsch 的干燥成熟种子。（批号57-24-9），成都普瑞法科技开发有限公司；钩吻素甲（批号MUST-15071312，纯度≥98%）
、钩吻素子（批号MUST-15062614，纯度≥99%）、钩吻素己（批号MUST-14100901，纯度≥96%），成都曼思特生物科技开发有限公司；胡蔓藤碱丙（批号BBP02553，纯度≥97.5%）、胡蔓藤碱乙（批号BBP02653，纯度≥95%），云南物科技有限公司；钩吻绿碱对照品（批号P15A10S85857，纯度≥95%），上海源叶生物科技有限公司。钩吻6种生物碱对照品化学结构见图1。0.9%氯化钠注射液（批号170807A41，福州海王福药制药有限公司），乙腈、甲醇、甲酸为谱纯，其余试剂为分析纯。
SPF级KM小鼠30只，雌雄各半，体质量18～22 g，福建中医药大学实验动物中心购于上海斯莱克实验动物有限责任公司，动物生产许可证号SCXK （沪）2017-0005。饲养于福建中医药大学实验动物中心SPF级屏障系统，温度（24±2）℃，相对湿度50%～70%，12 h/12 h光暗循环，自由摄食饮水，实验前适应性喂养7 d。
仪用放大器
图1 钩吻6种生物碱对照品结构图
2 方法与结果
2.1 谱和质谱条件
2.1.1 UPLC-QDa谱条件
谱柱：ACQUITY UPLC BEH-C18（2.1 mm×100 mm，1.7 µm）；流动相：乙腈（A）-0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脱（0～0.5 min，12%A；0.5～8 min，12%～20%A；8～11 min，20%A；11～17 min，20%～30%A；17～22 min，30%～40%A；22～28 min，40%～70%A；28～30 min，70%A；30～31 min，70%～12%A；31～33 min，12%A）；进样量：10 µL；检测波长：254 nm；柱温：40 ℃；流速：0.25 mL/min。
2.1.2 UPLC-QDa质谱条件
检测器：Waters QDA质谱检测器；离子源：电喷雾离子源（ESI）；扫描方式：正离子SIR扫描；正离子模式毛细管电压：0.8 kV；锥孔电压：15 V；采样速率：10点/s；扫描质量范围：100～1000 Da。2.1.3 UPLC-MS/MS谱条件
谱柱：ACQUITY UPLC® BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 µm）；流动相：0.1%甲酸水（A）-甲醇（B），梯度洗脱（0.0～1.0 min，80%～80%A；1.0～3.0 min，80%～50%A；3.0～5.0 min，50%～20%A；
5.0～
6.0 min，20%～10%A；6.0～9.0 min，10%～10%A；9.0～9.5 min，10%～90%A；9.5～12.0 min，90%～90%A）；柱温：45 ℃；流速：0.25 mL/min，进样量：2 µL。
2.1.4 UPLC-MS/MS质谱条件
电喷雾离子源，正离子多反应监测模式（MRM），载气为氮气，碰撞气体为氩气，离子源温度150 ℃，毛细管电压3.5 kV，脱溶剂气流（N2）800 L/h，脱溶剂温度500 ℃，锥孔气流（N2）50 L/h，二级锥孔萃取电压3.00 V，停留时间5 ms。6种钩吻生物碱及内标的质谱分析参数见表1。
表1 钩吻6种生物碱及内标质谱测定条件
成分分子式
保留时间
/min 定量离子对
锥孔
电压/V
碰撞能量
/keV
钩吻素子C20H23N2O 3.54 307.17→238.25 25 20 钩吻素甲C20H23N2O2 2.88 323.17→ 70.00 30 25
钩吻素己C19H22N2O3 3.90 327.17→296.00 30 18 钩吻绿碱C21H25N2O3 3.88 353.10→321.95 20 18 胡蔓藤碱乙C21H27N2O3 4.38 355.11→309.09 25 20 胡蔓藤碱丙C19H23N2O4 3.18 343.00→312.04 45 18 （内标）C21H22N2O2 3.33 395.00→324.04 40 30 2.2 对照品溶液制备
2.2.1 UPLC-QDa检测对照品溶液
精密称定适量的钩吻素子、钩吻素甲、钩吻素己、胡蔓藤碱丙、钩吻绿碱及胡蔓藤碱乙对照品，置于容量瓶中，加入甲醇，慢摇使其充分溶解，定容，得对照品母液。再用甲醇稀释，得到钩吻素子、钩吻素甲、钩吻素己、胡蔓藤碱丙、钩吻绿碱、胡蔓藤碱乙的浓度分别为117.17、114.14、117.17、110.73、107.07、110.83 µg/mL的混合对照品贮备液。
2.2.2 UPLC-MS/MS检测对照品溶液
精密称取适量钩吻素子、钩吻素甲、钩吻素己、钩吻绿碱、胡蔓藤碱乙、胡蔓藤碱丙，置于容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，得到单一对照品贮备液，浓度分别为1160.0、1130.0、1160.0、1060.0、133.0、87.7 µg/mL，4 ℃冷藏保存，备用。分别取上述单一对照品贮备液适量，用50%甲醇稀释成系列浓度的混合对照品溶液。精密称取适量，置于容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，得到内标贮备液。取内标贮备液适量，用甲醇稀释，得到浓度为14 ng/mL 的内标溶液，4 ℃冷藏保存，备用。
2.3 供试品溶液制备
2.3.1 抵当汤供试品溶液
参照前期研究[15]提取抵当汤药物，浓缩后得到浓度为3.5 g/mL的抵当汤母液，精密量取抵当汤母液4
00 µL，置于2 mL容量瓶中，用50%甲醇水稀释至刻度，振摇均匀，精密量取200 µL，用20%甲醇水稀释至0.14 g/mL，得抵当汤供试品溶液。
2.3.2 钩吻供试品溶液
称取钩吻样品3 g，粉碎，置圆底烧瓶中，用90%乙醇浸泡1 h后，回流提取2次，每次1 h，合并2次提取液，减压浓缩至无醇味，用超纯水溶解，转移至10 mL容量瓶中并稀释至刻度，振摇均匀，得浓度为0.3 g/mL的钩吻母液（以钩吻原药材量计）。精密量取钩吻母液90 µL，置2 mL容量瓶中，用50%甲醇水稀释至刻度，振摇均匀，精密量取200 µL，用20%甲醇水稀释至2.7 µg/mL，得钩吻供试品溶液。
2.3.3 混合供试品溶液
精密量取钩吻母液90 µL、抵当汤母液400 µL，置2 mL容量瓶中，用50%甲醇水稀释至刻度，振摇均匀，精密量取200 µL，用20%甲醇水稀释至抵当汤浓度为0.14 g/mL、钩吻浓度为2.7 µg/mL，得混合供试品溶液。
2.3.4 血浆样品制备
参照前期研究[15]将小鼠分为空白组、钩吻组、抵当汤＋钩吻组，每组10只，雌雄各半，给药剂量参
照前期研究，钩吻1.5 g/kg，抵当汤70 g/kg。小鼠灌胃给药10 min后，钩吻组出现中毒症状，抵当汤＋钩吻组症状较轻或无中毒症状。各组小鼠摘眼球取血，置于含肝素钠的采血管中，4000 r/min离心15 min，取上清液，-20 ℃保存，备用。精密吸取100 µL血浆于1.5 mL离心管中，加400 µL甲醇和100 µL内标溶液，涡旋1 min，14 000 r/min离心10 min，取上清液，于离心浓缩仪中吹干，加20%甲醇100 µL复溶，14 000 r/min离心10 min，取上清液，进样分析，每组样本平行分析3次。
2.4 方法学考察
2.4.1 UPLC-QDa方法学考察
2.4.1.1 线性关系考察
取“2.2.1”项下对照品溶液，按“2.1.1”项下谱条件及“2.1.2”项下质谱条件，测定钩吻素子、钩吻素甲、钩吻素己、胡蔓藤碱丙、钩吻绿碱、胡蔓藤碱乙的线性范围，结果见表2。各成分在相应范围内与峰面积呈良好线性关系。
表2 钩吻6种生物碱成分线性关系考察结果化合物回归方程线性范围/ng r
钩吻素子Y＝519 994.495X＋3 505 430.301 5.86～117.170.998
钩吻素甲Y＝470 348.911X＋4 444 298.760 5.71～114.140.998
钩吻素己Y＝678 033.839X＋5 456 991.261 5.86～117.170.998
钩吻绿碱Y＝249 347.911X＋1 248 747.671 5.35～107.070.999
胡蔓藤碱丙Y＝331 377.159X＋2 983 963.599 5.54～110.730.997
胡蔓藤碱乙Y＝409 876.079X＋2 283 670.925 5.54～110.830.998 2.4.1.2 精密度试验
取“2.2.1”项下混合对照品溶液，按“2.1.1”项下谱条件及“2.1.2”项下质谱条件连续进样测定6次，计算钩吻素子、钩吻素甲、钩吻素己、胡蔓藤碱丙、钩吻绿碱及胡蔓藤碱乙的峰面积，结果RSD分别为1.53%、0.45%、0.81%、1.65%、1.4%、1.53%，表明仪器精密度良好。
2.4.1.3 稳定性试验
取同一份钩吻及混合供试品溶液，分别于制备后2、4、8、12、24 h进样测定，钩吻供试品中钩吻素子、钩吻素甲、钩吻素己、胡蔓藤碱丙、钩吻绿碱及胡蔓藤碱乙含量RSD分别为0.87%、0.73%、0.65%、0.97%、1.09%、1.78%，混合供试品中钩吻素子、钩吻素甲、钩吻素己、胡蔓藤碱丙、钩吻绿碱及胡蔓藤碱乙含量RSD分别为1.14%、1.02%、1.52%、0.45%、0.68%、0.64%，表明供试品溶液在24 h内稳定。
2.4.1.4 重复性试验
称取同一批抵当汤及钩吻样品，按“2.3.1”“2.3.2”“2.3.3”项下方法制备钩吻、抵当汤及混合供试品溶液，按“2.1.1”项下谱条件及“2.1.2”项下质谱条件分别进样测定，计算钩吻供试品中钩吻素子、钩吻素甲、钩吻素己、胡蔓藤碱丙、钩吻绿碱及胡蔓藤碱乙的平均含量RSD分别为2.68%、1.33%、2.75%、2.95%、2.39%、2.13%，混合供试品中钩吻素子、钩吻素甲、钩吻素己、胡蔓藤碱丙、钩吻绿碱及胡蔓藤碱乙的平均含量RSD分别为2.21%、2.10%、2.10%、0.94%、1.27%、1.02%，结果表明本方法重复性良好。
2.4.1.5 加样回收率试验
顺势疗法
称取同一批钩吻样品1.5 g，各3份，加入与供试品待测成分含量近似相等的对照品，按“2.3.2”“2.3.3”项下方法制备钩吻及混合供试品溶液，按“2.1.1”项下谱条件及“2.1.2”项下质谱条件分别进样分析，结果表明，钩吻素子、钩吻素甲、钩吻素己、胡蔓藤碱丙、钩吻绿碱及胡蔓藤碱乙的加样回收率（RSD）分别为98.01%（0.86%）、95.53%（1.96%）、103.35%（1.32%）、97.28%（2.30%）、102.17%（1.46%）、97.88%（1.58%），表明加样回收率良好。
2.4.2 UPLC-MS/MS方法学考察
2.4.2.1 线性关系考察
按“2.1.3”“2.1.4”项下条件测定空白血浆中钩吻素子、钩吻素甲、钩吻素己、钩吻绿碱、胡蔓藤碱乙、胡蔓藤碱丙线性范围，结果见表3。各成分在相应范围内与峰面积呈良好线性关系。
表3 血浆中钩吻6种生物碱成分线性关系考察结果
成分回归方程线性范围/pg r
钩吻素子Y＝0.006 5X＋0.029 4 0.928～46.400 0.998 钩吻素甲Y＝0.197 6X＋0.204 0 0.904～45.200 0.999 钩吻素己Y＝0.439 8X＋0.565 7 0.928～46.400 0.999 钩吻绿碱Y＝0.090 8X＋0.126 1 0.848～42.400 0.999 胡蔓藤碱乙Y＝0.079 2X＋0.019 2 1.064～53.200 0.998 胡蔓藤碱丙Y＝0.305 3X＋0.209 4 1.754～87.700 0.999 2.4.2.2 稳定性试验
给斯大林的礼物
红账簿取3份空白血浆各100 µL，分别加入高、中、低浓度混合对照品贮备液，按“2.3.4”项下方法处理，分别于制备后0、2、4、6、8、10、12、24 h进样分析，计算空白血浆样品中钩吻素子、钩吻素甲、钩吻素己、钩吻绿碱、胡蔓藤碱乙、胡蔓藤碱丙的峰面积，结果RSD分别为7.13%、7.05%、5.02%、5.82%、6.19%、7.07%，表明血浆样品在24 h内稳定。
2.4.2.3 精密度试验
取高、中、低浓度的含有对照品血浆样品，按“2.3.4”项下方法处理，进样分析。日内平行测定6次，计
算日内精密度；连续测定6 d，计算日间精密度。结果表明，钩吻素子、钩吻素甲、钩吻素己、钩吻绿碱、胡蔓藤碱乙、胡蔓藤碱丙的日内精密度RSD 分别为3.03%、2.37%、1.58%、2.00%、1.89%、1.92%，日间精密度RSD分别为6.63%、5.78%、7.60%、5.45%、7.80%、7.25%，表明仪器精密度良好。
2.4.2.4 提取回收率与基质效应
取高、中、低浓度的混合对照品溶液进行测定，得相应峰面积A；取6份空白血浆100 µL，加入对照品溶液，分别制得高、中、低浓度样品，按“2.3.4”项下方法制备血浆样品并进样测定，得到相应峰面积B；另取6份空白血浆100 µL，按“2.3.4”项下方法处理后加入相应浓度的混合对照品溶液，使终浓度与前者浓度相对应，进样测定，得峰面积C。提取回收率（%）＝B/C×100%，基质效应（%）＝C/A×100%。钩吻6种生物碱成分高、中、低浓度的提取回收率见表4，基质效应见表5。
驻波
表4 钩吻6种生物碱成分提取回收率（%）
成分高浓度中浓度低浓度钩吻素子97.70±0.83 84.68±0.70 92.06±1.88
钩吻素甲98.63±0.52 91.54±0.97 87.65±2.20
钩吻素己97.19±1.98 92.92±2.61 87.55±1.01
钩吻绿碱 104.95±4.12 99.30±7.09 94.31±4.64
胡蔓藤碱乙 93.21±4.46 86.24±6.00 82.80±1.89
胡蔓藤碱丙102.18±0.83 97.68±0.47 93.26±1.96
表5 钩吻6种生物碱成分基质效应（%）
成分高浓度中浓度低浓度钩吻素子91.49±0.76 95.98±7.81 110.55±11.00 钩吻素甲97.05±1.88 93.31±0.75
88.08± 0.37
钩吻素己90.39±0.97 91.80±0.69
92.60± 3.64
钩吻绿碱94.33±0.34 90.33±1.37
95.42± 0.76
胡蔓藤碱乙 92.59±2.76 89.84±0.77
89.62± 1.50
胡蔓藤碱丙102.23±0.26 92.40±0.04
88.88± 1.58
2.4.2.5 专属性试验
取空白血浆加对照品混合液、内标溶液，采用UPLC-MS/MS检测条件进行测定，同时做空白血浆、给药血浆的对照试验，分析比较三者的谱图，结果见图2。可以看出，、钩吻素子、钩吻素甲、钩吻素己、钩吻绿碱、胡蔓藤碱乙、胡蔓藤碱丙的出峰时间分别约为3.25、3.46、2.77、3.82、3.80、4.30、3.08 min。UPLC-MS/MS检测结果显示，在上述谱条件下，空白血浆中未出现明显谱峰，表明空白血浆中内源性杂质不干扰钩吻成分的测定；且抵当汤中各成分也不干扰钩吻成分的测定，分离效果良好，本方法专属性良好。
钩吻素子
钩吻素甲
钩吻素己
钩吻绿碱
胡蔓藤碱乙
胡蔓藤碱丙
A B C D
注：A.空白血浆；B.空白血浆＋内标＋对照品；C.钩吻给药血浆；D.抵当汤＋钩吻给药血浆
图2 钩吻6种生物碱成分及内标专属性试验谱图
2.5 样品含量测定
按“2.1”项下条件采用UPLC-QDa、UPLC-MS/MS 检测钩吻、抵当汤、混合供试品及钩吻组、钩吻＋抵当汤组血浆样品，依次进样并记录峰面积，按标准曲线分别计算钩吻素子、钩吻素甲、钩吻素己、胡蔓藤碱丙、钩吻绿碱及胡蔓藤碱乙含量。采用SPSS23.0统计软件进行分析。数据以—x±s表示，组间比较采用配对样本t检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。 UPLC-QDa检测结果显示，与抵当汤
混合后，钩吻6种生物碱成分均呈下降趋势，钩吻素子、钩吻素甲、钩吻绿碱、胡蔓藤碱乙含量较钩吻样品明显降低（P＜0.01），见表6。UPLC-MS/MS检测结果显示，与钩吻组比较，抵当汤＋钩吻组小鼠血浆钩吻素子、钩吻素甲、钩吻素己、钩吻绿碱、胡蔓藤碱乙、胡蔓藤碱丙均明显下降，差异有统计学意义（P＜0.01），见表7。抵当汤联合钩吻后，钩吻6种生物碱成分的体内外变化趋势相同，可以初步判断抵当汤对钩吻减毒作用机制与降低这6种生物碱成分含量相关。
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