RFLP检测内皮一氧化氮合酶基因多态性一、实验背景
PCR-RFPL
DNA分子水平上的多态性检测技术是进行基因组研究的基础。RFLP（限制片段长度多态性）已被广泛基因组遗传图谱构建、基因定位以及生物进化和分类的研究。RFLP是根据不同个体基因组的限制性内切酶的酶切位点发生改变，或酶切位点之间发生碱基的插入、缺失，导致酶切片段大小发生变化，这种变化也可以通过特定探针杂交进行检测，从而可以比较不同个体DNA水平的差异（即多态性）。 一氧化氮合酶（NOS）是一种催化小分子信息化合物，一氧化氮生成的酶广泛参与免疫调节、神经传递、血压生理调控和血小板凝聚的抑制等多种生理功能。与高血压、糖尿病、肾病等多种疾病的发生密切相关。NOS可以分为三型：神经元型、诱导型、内皮型。内皮型一氧化氮合酶（NOS3，又称eNOS）基因在人类染体上定位于7q35~7q36区域，跨度约21kb，含有26个外显子和25个内含子，相应的信使核糖核酸（mRNA）约4.1kb，翻译成含1203个氨基酸的蛋白产物。
近年来已知的NOS3的3个基因多态性位点与原发性高血压的关系。
1、位于第4内含子上的27bp数目可变的串联重复序列（VNTR），根据重复次数不同有两种等位基因，
重复4次为a等位基因，重复5次为b等位基因。
2、位于第8外显子上，由于894位碱基G突变成T（G894T，即rs57135373），导致相应蛋白产物第298位上的谷氨酸被替换成天冬氨酸（Glu298Asp），突变前后的等位基因分别成为G、T等位基因。
3、位于5端侧翼区上786位碱基T突变成C（T786C），突变前后的等位基因分别为T、C等位基因。
G894T多态性
开放式数控系统
1.与血管痉挛的关系：最近的研究显示带有G894T的NOS3基因转染细胞后可以分裂成100Kda和35Kda的两个片段，影响NOS3的功能导致NOS3合成减少或功能下降，NO减少，冠状动脉紧张性升高诱发冠状动脉痉挛。这些研究说明，NOS3的G894T多态性可能影响血管内皮功能，使血管阻力增加，导致原发性高血压。
2、与原发性高血压的关系：1998年Lacolley等在法国高加索人中首次对G894T变异与原发性高血压关系进行研究，发现原发性高血压组中G等位基因频率显著高于对照组。Miyamoto等对日本京都和熊本两个独立人的研究结果
正好与Lacolley相反，原发性高血压T等位基因频率显著高于对照组，提示T 等位基因是日本人原发性高血压的危险因子。Shoji等研究了183例原发性高血压患者和193例正常对照者，发现NOS3的G894'T
变异与原发性高血压相关，具有G894T等位基因的原发性高血压患者比没有变异等位基因的舒张压和平均动脉压明显增高。
二、实验目的
本实验将综合运用微量全基因组DNA的提取，PCR-RELP的酶切，琼脂糖凝胶电泳技术，进行高血压你内皮一氧化氮合酶（NOS3）基因多态性的检测。
三、实验原理
应用可以特异性结合DNA的离心附柱和独特的缓冲液系统，提取多种细胞中的基因组DNA。离心吸附柱采用硅基质材料，能够高效、专一吸附DNA，可最大限度去除杂质蛋白及细胞中其他有机化合物，提取的基因组DNA片段大，纯度高，质量稳定。PCR技术实际上是在模板DNA、脱氧寡核苷酸引物和4种dNTP底物存在的条件下依赖于DNA聚合酶进行的酶促合成反应。PCR技术的特异性取决于引物和模板DNA结合的特异性。 PCR全过程包括三个基本步骤：
（1）双链DNA模板加热变性成单链（变性）；
（2）低温条件下引物与单链DNA互补配对（退火）；
（3）在适宜的温度下DNA聚合酶催化引物沿着摸版DNA延伸。
这三个步骤构成的步骤循环进行，35个循环可使特异性模板DNA扩增235倍。
循环的温度和时间：变性94℃，30~60s；延伸72℃,30~90s；退火温度为引物Tm，30~60s，（根据要扩增的靶DNA片段的大小来确定各阶段的时间）TaqDNA聚合酶：耐热—72℃活性最高，95℃仍有活性，可以提高退火和延伸的温度（大于50℃），以利于引物与模板的精确配对。
引物：15~30bp，Tm=4（G+C）+2（A+T）。过短使扩增的效率降低。本实验使用引物序列如下：
G894T上游5’AAGGCAGGAGACAGTGGATG 3’
G894T下游5’AGGATGTTGTAGCGGTGAGG 3’
扩增产物长：498bp
DNA纯度、缓冲液、温度条件及限制性内切酶本身都会影响限制性内切酶的活性。大部分限制性内切酶不受RNA或DNA的影响。如果采用两种限制性内切酶，必须分别提供最适性盐浓度。若可用同一缓冲液，则可同时水解。若需要不同的盐浓度，则低盐浓度的限制性内切酶必须首先使用，随后调节盐浓度，再用高浓度的限制性内切酶水解。也可在第一个酶切反应完成后，用等体积酚/氯仿抽提0.1倍
体积3mol/LNaAc和2倍体积无水乙醇，混匀后置-70℃低温冰箱水解30分钟，离心、干燥、重新荣誉缓冲液后进行第二个酶切反应。
BanⅡ的酶切序列：G GGCC C
C CCGG G
多态性位点为T时，限制性酶切位点消失：TGGCCC
ACCGGG
PCR产物经BanⅡ酶切后出现3种带型：
（1）T/T纯合子不会被切断，酶切后电泳条带为498bp；
（2）G/G纯合子酶切后电泳条带为338bp与160bp；
（3）T/G杂合子酶切后电泳条带为498bp、338bp与160bp。
江口涣
核酸在pH高于其等电点的溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。琼脂糖凝胶具有多孔的网状结构，以其为介质电泳时，不同大小的核酸可借凝胶的分子筛作用而得以分开。用溴化乙锭染后，在紫外灯下，可见染成橘红的核酸条带。琼脂糖凝胶常制成水平平板状，电泳缓冲液覆盖在平板表面，加样后，再通电电泳，故又称为潜水式电泳。
四、实验仪器
移液器；高速离心机；水浴箱；PCR仪；低压电泳仪；水平电泳槽；紫外检测仪。
五、实验试剂与耗材
实验试剂：蛋白酶K（储存于-20℃）；缓冲液GA；缓冲液GB；去蛋白液GD；漂洗液PW；吸附柱CB；洗脱缓冲液TE；无水乙醇；ddH2O；Taq Mix引物；限制性内切酶BanⅡ；10×酶切缓冲液；琼脂糖；6×上样缓冲液；1×TAE电泳缓冲液；10mg/ml溴化乙锭（EB）。
实验耗材：Tip头；头盒；1.5ml Eppendorf管；离心管盒；0.2ml Eppendorf 管；5号管血样2xxpp
六、实验步骤
1、组织基因组DNA的提取
按照基因组DNA提取试剂盒说明书步骤进行DNA提取。（采用的是天根生化有限公司生产的TIANamp Genomic DNA Kit）
（1）处理材料
取200μL冷冻过的5号管血液，不足200μL的可加GA补足。
（2）加入20μL蛋白酶K溶液，混匀。
（3）加入200μL缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10分钟，溶液应变清亮，简短离心以除去管盖内壁的水珠。
芮成钢领导者（4）加入200μL无水乙醇，充分震荡混匀15秒，此时可能出现絮状沉淀短离心以除去管盖内壁的水珠。
（5）将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中（吸附柱放入收集管中），12000 rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。
（6）向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD（使用前检查是否已加入无水乙醇），12000 rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。
（7）向吸附柱CB3中加入700μL漂洗液PW（使用前检查是否已加入无水乙醇），12000 rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。
（8）向吸附柱CB3中加入500μL漂洗液PW，12000 rpm离心30秒，倒掉废液。
（9）将吸附柱CB3放回收集管中，12000 rpm离心2分钟，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
（10）将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50~200μL洗脱缓冲液TE，室温放置2-5分钟，12000 rpm离心2分钟，将溶液收集到离心管中。
2、聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）
（1）制备反应体系：取一只0.2ml无菌Eppendorf管按一下配方加入试剂：
表1 PCR反应体系表
盖革模式编号
3 5 7
试剂μL
Taq Mix 12.5 12.5 12.5
ddH2O 8.5 6.5 4.5
DNA 3.0 5.0 7.0
Primer1 0.5 0.5 0.5
Primer2 0.5 0.5 0.5
总体积30.0 30.0 30.0
（2）震荡混匀后，离心10s
（3）将小管放入PCR仪中，设置程序：
95℃2min
94℃30s; 63℃30s; 72℃45s; 共35个循环
72℃7min
4℃∞
（4）运行程序
（5）程序结束后，取出小管，放入-20℃冰箱冻存。
本次实验所用引物序列为：
G894T 上游5’ AAGGCAGGAGACAGTGGATG 3’
G894T 下游5’ AGGATGTTGTAGCGGTGAGG 3’
扩增产物长度：498bp
3、限制性酶内切分析
（1）取一只0.2ml Eppendorf管，按下表加入试剂并混匀。
灭菌水7μL
10×酶切缓冲液 2μL
BanⅡ1μL
PCR产物10μL
总体积20μL
（2）震荡混匀后，瞬时离心。
（3）于37℃保温5个半小时。
（4）酶切结束后，在65℃保温10分钟终止反应。
（5）取出反应管，放入-20℃冰箱冻存。
4、琼脂糖凝胶电泳
（1）制备琼脂糖凝胶：称取0.225g的琼脂糖，溶解在15ml 1×TAE中，置微波炉中加热至琼脂糖深化均匀。在凝胶中加入溴化乙锭，摇匀，待凝胶冷却到50℃左右时，倒入模具中，除去气泡，于室温冷却凝固。
（2）待凝胶冷却凝固后，拔出梳子，放入电泳槽。在电泳槽内加入电泳缓冲液1×TAE，使电泳缓冲液刚好盖过胶面。
（3）待测DNA样品（PCR产物；酶切产物）与1/5体积的上样缓冲液混匀后进行电泳，记录样品次序与点样量，在样品的一侧点样孔中加入分子量标准。
（4）打开电源开关，选择80V电压进行电泳。
（5）电泳至蓝条带到达边缘的2/3处停止电泳。
（6）将凝胶取出在紫外透射仪上观察并照相。
七、实验结果与分析
中国麻风皮肤病杂志
图1 PCR产物电泳图
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