作者单位:210002南京军区军事医学研究所(朱敏生、潘英、许祥裕、沈月)；南京儿童医院神经外科(王刚、范毓华)；美国西南医学中心(智刚、K im S Lau、James T S tull)・论著・
朱敏生 潘英 王刚 许祥裕 范毓华 沈月 智刚 K im S Lau James T Stull
【摘要】 目的 检测正常人与Duchenne肌营养不良症(DM D)患儿肌肉中脑型一氧化氮合酶(nNOS)mRNA及其蛋白的表达水平。方法 建立高敏感性的RNA酶保护实验，并通过Western blot 分析的方法，对10例DM D肌肉标本和5例正常儿童肌肉标本中nNOS mRNA及其蛋白表达情况进行检测。结果 DM D患儿肌肉中nNOS mRNA的表达量只有正常肌肉的10%,nNOS蛋白亦有相同的表达规律。结论 nNOS蛋白在DM D肌肉细胞和肌膜上呈低含量，是由于nNOS在转录水平上合成减少所致。
【关键词】 一氧化氮合酶;RNA，信使；肌营养不良
Differential expression of nN OS mRNA and nN OS protein in norm al and Duchenne muscular dystrop
hic muscles ZH U Minsheng3,P AN Ying,WANG Gang,et al.3Nanjing Military Institute o f Medical Sciences, Nanjing210002,China
【Abstract】 Objective T o com pare the expression level of neuronal nitric oxide synthase(nNOS)mRNA and nNOS protein in normal and Duchenne muscular dystrophy(DM D)muscles.Methods The authors developed m odified highly sensitive RNase protection assay and western blot assay,and thereby determined nNOS mRNA and its protein in skeletal muscles of10DM D patients and5normal control children.R esults The results showed that the expression of nNOS mRNA in DM D muscles was only10%of that in normal muscles.Accordingly,nNOS protein expression level in DM D muscles was als o significantly lower than that in normal muscles.Conclusion The decrease of nNOS protein in skeletal muscles of DM D patients may be due to low expression of nNOS mRNA at transcription level.
【K ey w ords】 Nitric2oxide synthase;RNA,messenger;Muscular dystrophy
Duchenne肌营养不良症(Duchenne muscular dystrophic,DM D)是一种常见的儿科遗传病，主要病因是由于抗肌萎缩蛋白(dystrophin)先天缺陷[1,2]。主要病理过程为肌肉纤维进行性萎缩变性，坏死和脂肪填充。dystrophin是一个膜结构蛋白，近年来发现它能与脑型一氧化氮合酶(neuronal nitric synthase,
nNOS)通过G LG F氨基酸序列相结合，并将nNOS锚定于肌膜上。当dystrophin缺乏时，这种结合丧失或减弱[123]，此时,nNOS仅存在于肌纤维胞质中，有人认为这种游离形式的nNOS可能与DM D损伤有关[4]。但人们又发现在mdx小鼠(已先天剔除dystrophin)的肌肉中，不但nNOS在肌膜上消失，而且nNOS mRNA也逐渐减少[5]。这就提示游离形式的nNOS亦会随之减少，难以成为DM D损伤的重要因素。由于动物模型和人往往存在着多方面的差别，在人DM D肌肉中nNOS的表达情况如何是值得探讨的问题。由于nNOS mRNA在组织中的丰度很低且标本取材受限，测定其mRNA水平较难。我们通过改良，建立了高敏感性的RNase保护实验，成功地比较了nNOS蛋白和mRNA在正常儿童和DM D肌肉中表达水平，为研究nNOS在DM D损伤中的作用提供了依据。
材料和方法
一、材料
1.主要酶、蛋白、DNA及试剂：各种分子生物学工具酶购于Promega公司、华美试剂和Fluka公司；标记的RNA合成混合物、碱性磷酸酶标记的
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抗抗体和酶底物购于宝灵曼公司;Z eta尼龙膜购于BioRad公司；大肠杆菌tRNA、硫酸葡聚糖、甲酰胺购于华美公司，其他试剂购于Sigma公司和国产分析纯试剂。
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2.质粒和细菌:pC M V/nNOS：由美国西南医学中心K im S Lau提供，该质粒含有大鼠nNOS的全长cDNA。p GE M3z购于Promega公司;p GE M/actin质粒由智刚教授提供;JM109细菌由本室保存。
3.肌肉标本来源及临床资料:10例DM D腓肠肌标本均来源于南京市儿童医院，年龄4～12岁，男性。经临床诊断，病理活检和肌电图诊断为DM D,5例正常儿童腓肠肌标本分别为南京市儿童医院和江苏省人民医院正常的外伤儿童的新鲜标本。
二、方法
1.PCR、体外转录等基本操作按分子克隆手册[6]进行。
2.RNA的提取：采用一步法[7]提取RNA。
3.改良RNase保护实验：首先制备RNA探针。用PCR方法扩增nNOS特异性序列(7012881aa)，再将扩增产物克隆入p GE M3z中，经线性化后得到模板DNA，按宝灵曼公司的产品说明书进行各种RNA 探针的制备。将1μg标记的RNA探针与不同剂量的样品RNA混合溶解在杂交液中(40mm ol/ L、pH6.4,E DT A1mm ol/L、pH8.0,NaCl0.4m ol/ L,80%甲酰胺),80℃孵育10min后，置于50℃杂交至少4h。向杂交后孵育液中加入300μl的RNase/DNase I消化液(RNase40μg/ml,DNase I5U/ ml,E DT A5mm ol/L、pH7.5,Tris Cl10mm ol/L、pH 7.4,NaCl300mm ol/L)，在30℃孵育60min，酚氯仿抽提1 次后，通过狭缝印迹转移到Z eta尼龙膜上，用T BST洗膜,T BST/5%奶粉封闭，然后用碱性磷酸酶标记的抗抗体Fab孵育,NBT/BCIP作底物液显。
4.Western blot分析：参见我们以前采用的EC L 化学发光法[8]。
5.nNOS RNA探针的制备：按我们以前的报道扩增nNOS特异性基因片段[9]，将此片段用XhoⅠ和BamHⅠ酶切，与已用相同酶酶切的p GE M3z载体连接，筛选得到重组质粒DNA，再用BamHⅠ或Xho Ⅰ单酶切，即得到可供体外转录的DNA模板。当用T7RNA聚合酶时可得到nNOS的反义RNA探针，用以检测nNOS的mRNA；当用SP6RNA聚合酶时即得到nNOS有义RNA探针，用作阴性对照。alpha2actin 线性模板由T7RNA聚合酶转录后得到反义探针，用于RNA检测的内标准。
结果
一、nNOS mRNA在DM D和正常肌肉中的表达
将不同剂量的正常腓肠肌的RNA样品与nNOS 反义RNA探针杂交，杂交后转移到尼龙膜上进行常规免疫检测。实验结果表明：当正常肌肉RNA样品量为10μg时可检测到很强的阳性信号，当RNA样品量为0.1μg时亦可检测到明显的阳性信号，通过黑度扫描可以发现样品量与杂交信号有良好的线性关系。将DM D样品RNA也按梯度稀释进行杂交，发现DM D肌肉中的mRM A水平明显低于正常对照，尤其是上
样量为0.5μg时这种差别更为易见。另外，当用细菌tRNA代替样品RNA时，未见明显的杂交信号，用有义RNA探针时亦未见任何杂交信号，说明该改良的杂交方法为特异性杂交。
为了定量比较nNOS mRNA的差别，我们在以下的实验中上样量均为0.5μg，通过扫描的方法定量测得各组的相对百分比，经计算测得DM D肌肉中mRNA的表达量仅为正常肌肉的(10±2.6)%，差异有显著意义(P<0.01)。
二、nNOS蛋白在DM D肌肉中的表达
常量元素将肌肉组织匀浆，直接加入载样缓冲液，进行S DS2PAGE电泳、膜转移，用nNOS抗体[10]作为一抗进行Western blot分析。结果可见正常肌肉中有明显的nNOS蛋白阳性带，而DM D组的蛋白阳性带不明显。
讨论
NO是一个性质极为活泼的自由基信使分子，在信号传导，自由基损伤等过程中发挥着重要作用。NOS主要由三种NOS同功酶合成,NOS的含量变化与NO的产量直接相关[11]。在正常横纹肌肌膜，肌结头等处含有大量的nNOS，而DM D时含量明显减少[325]，这就提示nNOS在横纹肌功能和DM D损伤的过程中可能起重要作用。我们通过Western blot 的方法亦证实,DM D肌肉中的nNOS含量明显减少。
这种减少有人认为nNOS膜转运失常所致。我们的研究结果证实，人DM D肌肉中的nNOS mRNA水平明显低于正常组，且nNOS蛋白的表达亦有相似的规律，这一结果与mdx动物实验的结果[5]是一致的。这也就提示:DM D肌肉中nNOS的减少可能是由于
心宽一寸病退一丈nNOS在转录水平合成降低所致，而并不是向膜外转运障碍引起的。
目前已发现，肌肉细胞中还存在有营养不良的补偿蛋白[12,13]，如Utrophin等类似蛋白。该蛋白的N端亦含有G LG F氨基酸序列，能与nNOS结合，当营养不良蛋白缺乏时可代替nNOS的膜转运过程，这一事实亦支持上述推论。
Bredt[4]1996年提出，在DM D进行性损伤过程中，由于nNOS的转运障碍，导致肌肉纤维中NO产量过高,NO与O2形成强毒性的过氧化氮自由基，进而引起DM D进行性损伤。根据本结果和已往报道，这一假说是难以成立的。
nNOS mRNA在细胞中的表达速度非常低，加上临床取材量少，检测mRNA水平非常困难.我们曾用常规的Northern blot和RNase保护实验，均未检测成功。本次将RNase保护实验进行改良后，敏感性大大提高。改良后的方法具有简便，不需同位素，敏感性高以及易于定量分析等优点，对检测低丰度RNA 水平尤为适用。
参考文献
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8朱敏生，沈月，许祥裕，等.细胞性一氧化氮供体的建立及其对肿瘤细胞凋亡的诱导效应.中华微生物和免疫学杂志,1998, 18:1972201.
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10陈强，朱敏生，沈月，等.nNOS特异性片段的重组表达及特异性抗体的制备.中国免疫学杂志,1998,3.15:71273.
11Lowenstein C J,Synder SH.Nitric oxide,a novel biologic messenger.
Cell,1992,70:7052707.
12朱敏生，许祥裕，沈月，等.脑型一氧化氮合酶在Duchenne进行性肌营养不良肌肉中的表达特征.江苏医药,1998,24增刊:2852 286.
13C om pbell K P,Crosbie RH.Muscular dystrophy:utrophin to the rescue.
白城地震Nature,1996,384:3082309.
(收稿日期:1999201208)
(本文编辑：江澜)
・病例报告・
右心房憩室合并房室折返性心动过速一例李虹 杨平珍 陈欣欣中国实行的社会养老保险基金运行模式是
患儿女,8岁。反复发作心悸8年。发作时心电图为阵发性室上性心动过速(S VT)，静止时为预激综合征(B型)。超声心动图：右心室前方囊状液性暗区32.7mm×20.3mm，与右心房相通。射频消融术中标测房室旁道位于右侧壁，选择功率40～50W，放电10～20s，共10～12次，不能阻断旁道传导。4个月后再次行射频消融术仍不成功。右心房造影：右心房前下游离壁一囊状显影(50mm×24mm)，与右心室无交通。心脏手术探查：右心房下部见一囊腔(50mm×25mm)，囊壁由心内膜、心肌及心外膜组成。心外膜标测：憩室与右冠状动脉之间房室沟处VA融合。术中切割憩室与右冠状动脉之间房室沟以及前隔交界处与后隔交界处之间房室沟并切除憩室。术后预激波消失。随访3个月，无S VT
作者单位:510100广州，广东省心血管病研究所儿科发作。
讨论：右心房憩室为罕见的先天性心脏病，易漏诊，仅在出现血栓、心律失常、心力衰竭或胸外伤破裂时才被发现。超声显示右心室前方囊状液性暗区，与右心房相通，不随心脏舒缩。右心房造影可明
确显示憩室的形态、大小及部位。本例两次消融不成功的因素推测为:(1)由于右心房憩室的存在，靶点不确切，消融导管难以到位;(2)憩室壁心肌组织可能参与折返激动，射频电流无法完全阻断其传导。因此，对于存在右心房憩室的房室折返性心动过速(AVRT)，经心内膜标测确定旁道位于憩室或其邻近组织后，可按常规先行射频消融术，如不成功，应选择外科手术，仔细标测心外膜，切割旁道并切除憩室。
(收稿日期:1999206215)
(本文编辑：滕淑英)
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