收稿日期：
2018-07-27 修回日期：2018-08-18
基金项目：国家自然科学基金(31750110474)
作者简介：丁玉娇，硕士研究生，从事低温分子生物学研究。E-mail: 1756148579@qq 注：韩颖颖为通信作者。E-mail: yyhan2007@163
丁玉娇，韩颖颖，周婧雯
(上海理工大学医疗器械与食品学院，上海 200082)
摘 要：蛋白质S-棕榈酰化是最常见的具有16碳脂肪酸棕榈酸酯的脂质修饰形式，调节蛋白质的运输和功能。文中主要概括从植物到哺乳动物中发现的具有棕榈酰基转移酶活性的保守DHHC 蛋白家族，并介
绍蛋白质棕榈酰化的研究方法，及检测棕榈酰化蛋白质的位点预测方法(CSS-Palm 、NBA-Palm 、TermiNator2)、放射性标记法(用3H 棕榈酸酯或125I-IC16棕榈酸酯)和非放射性标记法(化学标记和质谱法)，总结蛋白棕榈酰化的抑制技术以及抑制剂类型(包括2-溴棕榈酸酯、浅蓝菌素和衣霉素)。同时概括蛋白棕榈酰化在植物胁迫中的响应，展望其在植物抗逆中的应用前景。
关键词：棕榈酰化修饰；DHHC 蛋白；功能；研究方法；抑制剂
Doi: 10.3969/j.issn.1009-7791.2018.04.017
中图分类号：Q51 文献标识码：A 文章编号：1009-7791(2018)04-0395-09
Progress in Research of Palmitoylated Proteins and Protein Palmitoylation
DING Yu-jiao, HAN Ying-ying, ZHOU Jing-wen
(School of Medical Instrument and Food Engineering, University of Shanghai for Science and Technology, Shanghai 200082, China)
Abstract: Protein S-palmitoylation, the most common lipid modification with the 16-carbon fatty acid palmitate, provided an important mechanism for regulating protein trafficking and function. This articl
e summarized a family of conserved DHHC proteins with palmitoyltransferase activity that had been discovered from plants to mammals. The method of protein palmitoylation was so concluded. The paper also introduced the research methods of protein palmitoylation, the prediction methods of palmitoylation sites (CSS-Palm, NBA-Palm, TermiNator2), radioactive labeling (radiolabeling with 3H palmitate or 125I-IC16 palmitate) and non-radioactive labeling (chemical labeling and mass spectrometry) to detect palmitoylated proteins. Next, techniques to inhibit protein palmitoylation were described. These included site specific mutagenesis, and treatment of cells with inhibitors of protein palmitoylation, including 2-bromopalmitate, cerulenin, and tunicamycin. Based on the authors’ research directions, the response of protein palmitoylation in plant stress and the application prospect of plant stress resistance were summarized and prospected.
Key words: palmitoylation modification; DHHC protein; function; research method; inhibitor
蛋白质是生命的物质基础。蛋白质要经过基因转录、转录后加工、翻译、翻译后加工及转运等多个复杂过程后才具有生理功能。蛋白质的翻译后加工修饰形式包括磷酸化、糖基化、甲基化、羟基化、泛素化及脂质化等[1]，其中脂质化修饰是一种重要的翻译后加工修饰形式，而N-豆蔻酰化、棕榈酰化和法尼基化是重要的脂质化修饰形式[2]。目前报道的棕榈酰化修饰蛋白有100多种[3]，蛋白质棕榈酰化赋予其复杂的生理功能。
2018,47(4): 395～403.
Subtropical Plant Science
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绍兴越秀外国语职业学院
1 蛋白质棕榈酰化类型
蛋白质棕榈酰化修饰一般发生在半胱氨酸残基上，依据其连接方式可以分为S-棕榈酰化、N-棕榈酰化[4]和O-棕榈酰化[5—6]。N-棕榈酰化是棕榈酰基与甘氨酸/半胱氨酸(Gly/Cys)残基通过酰胺键连接[7]，因酰胺键较稳定，因此不可逆；O-棕榈酰化是棕榈酰基通过酯键与丝氨酸残基相连[6]；S-棕榈酰化是指含有16个碳原子的饱和棕榈酸和半胱氨酸(Cys)共价结合，形成不稳定的硫酯键[8]，这种棕榈酰化具有可逆性，可在时间和空间上调节蛋白质的功能，因此它是最重要的一种棕榈酰化修饰方式，本文
的论述主要针对S-棕榈酰化修饰。
S-棕榈酰化由棕榈酰基转移酶(Protein S-acyl transferase, PAT)和棕榈酰硫酯酶两种相反类型的酶动态调节[9]。
2 棕榈酰化蛋白及棕榈酰化修饰对蛋白质功能的影响
解放战争三大战役的最后一大战役
2.1 DHHC蛋白家族及其修饰底物的类型
DHHC-CRD结构域是一种富含半胱氨酸的高度保守的锌指结构域[10]，目前将富含DHHC-CRD结构域的蛋白质称为DHHC蛋白，它们共同组成DHHC蛋白质家族。大多数DHHC蛋白具有PAT活性，并且棕榈酰化主要修饰具有DHHC-CRD结构域的蛋白质，所以多种DHHC蛋白既是酶又是底物[11—12]。
棕榈酰化蛋白可以分为五大类。第一类是一类特定的跨膜蛋白，这类跨膜蛋白在跨膜结构域或跨膜结构域附近有半胱氨酸被S-棕榈酰化。第二类以Ras家族为代表，S-棕榈酰化发生在C-末端区域内并且C-末端“CAAX”盒子内的半胱氨酸残基首先要被异戊二烯化才能被S-棕榈酰化。第三类蛋白质是N-或C-末端附近的一个或多个半胱氨酸被S-棕榈酰化。第四类蛋白质以酪氨酸蛋白激酶Src家族的成员为代表，9个Src家族成员中的7个成员在N-端SH4结构域中含有双酰化的共有序列：Met-Gly-Cys。Gly-2被豆蔻酰化，Cys-3被S-棕榈酰化[12—13]，几个异源三聚体G蛋白的α亚基也属于此类[14]。第五类
是由Hedgehog(Hh)和Gαs亚基组成的棕榈酰化蛋白[15—16]。这些蛋白质的棕榈酸酯通过酰胺键共价结合到N-末端半胱氨酸残基(N-棕榈酰化)上。
2.1.1 酵母DHHC蛋白 Deschenes等[17]构建了一个非法尼基化的Ras2突变蛋白，使用这种突变酵母的合成致死基因筛选参与Ras2棕榈酰化的两个候选基因Erf2和Erf4[18]。研究表明，重组的Erf2和Erf4复合物在体外介导Ras2棕榈酰化[19]。Roth等[20]研究发现，酵母酪蛋白激酶2(Yeast casein kinase 2,Yck2)的棕榈酰化受Akr1调控。随后的研究发现，DHHC蛋白Pfa3[21]和Pfa4[22—23]都具有PAT活性，分别促进Vac8和Chs3的棕榈酰化。Swf1介导酵母SNARE蛋白的棕榈酰化，并能防止蛋白泛素化和降解[24]。酵母中共有7个DHHC蛋白，除以上5种之外，还有Akr2和Pfa5[25]，这些DHHC蛋白定位于高尔基体、内质网、质膜以及液泡上，而Pfa3是唯一具有液泡定位的蛋白[21,23]。
2.1.2 哺乳动物DHHC蛋白随着现代生物技术的发展与进步，对于蛋白质棕榈酰化的研究也从酵母扩展到哺乳动物。在小鼠和人类基因组数据库中有23个DHHC基因[26]。从遗传和生物化学方面对DHHC蛋白家族进行了一系列研究。例如，在小鼠中，DHHC13缺失的个体会出现多种老化相关表型，包括脱发、骨质疏松、全身淀粉样变性和早期死亡[27]；DHHC17起到调节突触和神经元的作用[28]；DHHC21突变最终会导致小鼠毛囊退化[29]。近年来，对于人细胞中DHHC相关蛋白的研究也进一步深入。Fernández-Hernando等[30]发现，在人的内皮细胞上存在DHHC2、DHHC3、DHHC7、DHHC8、DHHC21共5种DHHC蛋白，内皮一氧化氮(NO)合成酶(eNOS或NOS3)被S-棕榈酰化，能在
血管中合成NO，eNOS的棕榈酰化缺陷突变体释放较少的NO，并且eNOS的遗传缺失导致许多心血管表型，包括血压升高、血管生成受损、异常血管重塑和加速动脉粥样硬化[31]。有研究发现，DHHC2与结肠直肠癌、肝细胞癌和非小细胞肺癌相关，在这些癌细胞中，DHHC2表达明显下调[32]。DHHC9[33]和DHHC15[34]与X型智力低下相关。DHHC17与亨延顿舞蹈症直接相关[28]。因此，DHHC蛋白家族在人类生长发育过程中具有极其重要的作用。
第4期丁玉娇，等：棕榈酰化蛋白及蛋白质的棕榈酰化研究进展﹒397﹒
pdsc2.1.3 植物DHHC蛋白植物中DHHC蛋白家族研究相对较少，已报道玉米Zea mays、杨树Populus sp.、水稻Oryza sativa、拟南芥Arabidopsis thaliana分别有40、39、30、24个DHHC蛋白[35]。在其他低等植物中也发现数目不等的PAT。在这些DHHC蛋白中，只有TIP1和PAT10被深入研究，发现TIP1具有DHHC-CRD结构域且被证明具有棕榈酰化功能，它主要与拟南芥根毛形成、细胞伸长、花粉管形成密切相关[36]。PAT10棕榈酰化能调节类钙调神经磷酸酶B样蛋白(Calcineurin B-like proteins，CBLs)在液泡膜的定位，其功能缺失会导致拟南芥叶片变小、变矮且不育[37—38]。两种同源DHHC酰基转移酶PAT13和PAT14与拟南芥叶片衰老相关。在衰老的叶片中，PAT13和PAT14表达量升高，且PAT13和PAT14的双重突变体在早期就表现出严重衰老表型[39]。
2.2 棕榈酰化对蛋白质功能的影响
棕榈酰化影响蛋白质功能的多个方面。S-棕榈酰化是一种可逆的翻译后修饰，可调节蛋白质与膜结合、运输及蛋白质-蛋白质相互作用[40]。
2.2.1 棕榈酰化对动物蛋白质功能的影响在大鼠中，突触分化诱导的基因I(SynDIG1)在突触发育过程中起着关键作用，SynDIG1的棕榈酰化在调节其自身的稳定性和亚细胞定位中发挥重要作用[41]。在寄生虫中，肺泡蛋白是子囊网络(SPN)的主要组成部分。SPN是一种皮层细胞骨架，主要为细胞提供机械强度。研究发现，肺泡蛋白的棕榈酰化通过脂质锚定加强SPN与相邻内膜复合物之间的连接，从而增强细胞骨架功能[42]。
2.2.2 棕榈酰化对植物蛋白质功能的影响在拟南芥中，G蛋白γ亚基、α亚基和ROP10小GTP酶的棕榈酰化修饰在其细胞定位中起到重要的调节作用[43—44]；在水稻和拟南芥中，钙依赖性蛋白激酶(CKPKs)在N-末端附近有半胱氨酸残基，其棕榈酰化有利于蛋白质正确的膜定位[45—46]。Ueda等[47]发现拟南芥的Ara6是Rab/Ypt GTP酶家族的新成员，类似于Ara6的蛋白质仅在较高等的植物中发现，Ara6棕榈酰化和去棕榈酰化使得其在细胞器和细胞膜之间循环穿梭。Ara6还是以植物特异性方式调节内吞功能的新一类Rab GTP酶。综上所述，蛋白质的棕榈酰化有蛋白质特异性膜靶向，促进蛋白质转运和防止蛋白质降解的功能。
3 蛋白质棕榈酰化研究方法
3.1 棕榈酰化修饰位点的预测方法
棕榈酰化位点的识别有利于更好地理解棕榈酰化过程的分子调控机制。Xue等[48]、高祥等[49]开发了一个采用聚类和评分策略的CSS-Palm计算程序，该程序的数据集由83个蛋白质的210个棕榈酰化位点组成。迄今数据集扩展到105个蛋白质的245个棕榈酰化位点，并结合数个机器学习算法，包括朴素贝叶斯[50]、支持向量机(SVMs)[51]和RBF网络[52]进行棕榈酰化位点预测，该预测程序被称为NBA-Palm，其预测性能与CSS-Palm相当，但其准确性从82%提高至86%[48]。
Frottin等[53]创建了预测棕榈酰化位点的工具TermiNator2。这个预测工具是通过结合PHP/HTML/MySQL/JavaScript语言预测原核生物N-末端蛋氨酸切除(N-terminal methionine excision，NME)和其他相关真核生物N-末端修饰作为网络工具而创建的。它可以在www.isvrs-gif.fr/ terminator2/index.html线上获得。
3.2 放射性棕榈酸酯代谢标记法
放射性棕榈酸酯代谢标记法主要有3H标记棕榈酸酯和125I标记IC16棕榈酸酯两种方法。IC16棕榈酸酯(16-碘-十六烷酸)是含ω碳分子的棕榈酸酯类似物[14]。它与Na125I-碘化物反应产生125I-IC16棕榈酸酯以完成放射性标记[54]。使用125I-IC16棕榈酸酯标记棕榈酰化蛋白比用[3H]-棕榈酸酯有两个明显的优点：(1)IC16类似物表现出最小的代谢互换现象[55]；(2)125I发射的γ辐射可以通过磷成像技术更容
易地检测到，与3H相比，曝光时间大大缩短。
3.3 非放射性棕榈酸酯代谢标记法
3.3.1 酰基-生物素置换法(Acyl-biotinyl exchange，ABE) 化学标记棕榈酰化位点的方法是监测放射性
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标记棕榈酸酯掺入的非放射性替代方法[56]。首先用N-乙基马来酰亚胺处理棕榈酰化蛋白-棕榈酸酯的免疫沉淀复合物以阻断游离巯基。用1 mol·L-1羟胺以断开棕榈酰硫酯键使棕榈酰化蛋白-棕榈酸酯分离，由此产生游离巯基。然后将样品与1 μmol·L-1巯基特异性试剂生物素缀合的1-生物素酰氨基-4-[4'-(马来酰亚胺甲基)环己烷甲酰胺基]丁烷(Btn-BMCC)在室温下反应2 h，其定量标记新暴露棕榈酰化位点(新的游离巯基位点)。通过用辣根过氧化物酶(HRP)标记的链霉亲和素进行免疫印迹检测标记的蛋白三氯化钒
质[14]。
3.3.2 质谱分析法基质辅助激光解析电离飞行时间质谱法(MALDI-TOF MS)可用于检查附着于蛋白质的脂肪酸。质谱的优势在于它可以用来估算给定蛋白质棕榈酰化的化学计量，并提供修饰基团的精确质量[57—59]。质谱法还不能直接鉴定酰基部分，主要是由于脂肪酸的极性头部阻止其与棕榈酰化靶蛋白分离。这些方法对于研究S-棕榈酰化修饰酰基的功能和鉴定是必不可少的。
2013广东高考理综Sorek等[60]使用气相谱结合质谱法分析蛋白S-棕榈酰化，可以用少至1 μg的纯化蛋白进行分析，并可以进行化学鉴定，且对酰基部分进行定量。该方法通过铂(IV)氧化物氢化从蛋白质中分解脂肪酸，导致酰基的酸性酯交换，在脂肪酸的羧基头部添加乙基。乙基降低了脂肪酸的极性，使其能够通过气相谱进行有效分离。
3.3.3炔基基团棕榈酸类似物细胞代谢法该方法使炔烃脂肪酸类似物17-十八烷酸(17-ODYA)或类似的炔基化脂肪酸通过细胞棕榈酰化机制代谢掺入棕榈酰化的内源性位点[61—62]，然后通过Huisgen环加成反应将17-ODYA标记的蛋白偶联到叠氮化物报告标签上，进行棕榈酰化蛋白的质谱鉴定[63]。与ABE 相比，17-ODYA在活细胞中与蛋白质的自然结合可最大限度地减小检测误差。
3.3.4 酰基-树脂辅助捕获(acyl-RAC)法通过树脂辅助捕获(RAC)能快速鉴定蛋白质S-亚硝基化位点，Forrester等[64]扩展了此方法，其结合质谱的蛋白质组学来表征内源性S-棕榈酰化的新位点。与ABE
测定相比，acyl-RAC操作步骤较少，从而最大限度地减少了可能无意中发生错误的步骤数。简单可行性是acyl-RAC的最主要优点。酰基-RAC方法有助于在生理和病理条件下分析细胞蛋白的S-棕榈酰化。
4 蛋白质棕榈酰化的抑制与脱棕榈酰化
4.1 酰化半胱氨酸残基定点突变对蛋白质棕榈酰化的抑制作用
抑制棕榈酰化的最常见和直接的方法是使用位点特异性诱变产生编码突变形式的棕榈酰化蛋白，其中修饰的半胱氨酸残基突变为丙氨酸或丝氨酸。用编码蛋白质的突变型或野生型形式的cDNA载体转染细胞，使棕榈酸酯掺入每种形式。棕榈酰化蛋白的总量通过蛋白质印迹或免疫沉淀35S-甲硫氨酸标记的棕榈酰化蛋白进行测定。该方法的局限性是蛋白质功能的缺陷可能是由于丢失特定的半胱氨酸残基而不是棕榈酸修饰的缺失造成的。另外，该方法依赖于野生型和突变形式的棕榈酰化蛋白过表达，因此不能直接测量内源棕榈酰化蛋白的棕榈酰化[14]。
4.2 蛋白质棕榈酰化的药理学抑制剂
4.2.1 2-溴棕榈酸2-溴棕榈酸(2-Bromopalmitate, 2BP)能阻断棕榈酸酯结合到蛋白质上，该化合物作为蛋白质棕榈酰化抑制剂的有效性已被至少二十种棕榈酰化蛋白证实，包括Src家族激酶、Rho家族蛋白
、H-Ras、PSD95与跨膜受体(如烟碱α7受体和CCR5)[65—68]。该方法有三项优点：(1)使用的试剂简单且便宜；(2)可研究内源棕榈酰化蛋白的功能，而不需要过表达突变体；(3)修饰的半胱氨酸残基保持完整。
2BP与血清白蛋白和脂肪酸结合蛋白结合，亲和力与棕榈酸酯相似[69]。一旦进入细胞，2BP就转化为2BP-CoA。2-溴基团的存在能防止其通过β-氧化分解，因此2BP为棕榈酸酯的非代谢类似物。2BP 能结合并抑制肉毒碱棕榈酰转移酶-1[70]。2BP还可以抑制其他参与脂质代谢的酶，包括三酰甘油生物合成，脂肪酸辅酶A连接酶和甘油-3-磷酸酰基转移酶[71]。有研究报道2BP对NADPH细胞素C还原酶和葡萄糖-6-磷酸酶有抑制作用[72]。因此，2BP处理对细胞代谢产生多效性影响。
4.2.2 浅蓝菌素浅蓝菌素是一种天然抗生素，通过烷基化β-酮酰基载体蛋白合成酶抑制脂肪酸合成。浅蓝菌素抑制髓鞘脂质蛋白[73]和CD36的棕榈酰化[74]。有文献将浅蓝菌素的类似物作为研究蛋白质棕榈酰化的化学探针，并证实该探针有较多优点：(1)比2BP更高效；(2)不仅可以标记体内的棕榈酰化蛋
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白，还可以标记外源的棕榈酰化蛋白；(3)与棕榈酰化蛋白形成较稳定的硫酯键，不易被破坏；(4)不仅能标记保守的半胱氨酸残基位点，还能标记突变成丝氨酸或丙氨酸的位点[75]。
4.2.3 衣霉素衣霉素是一种核苷抗生素，以抑制蛋白质N-糖基化而闻名。衣霉素和棕榈酰CoA之间的结构相似性导致了衣霉素也可以抑制蛋白的棕榈酰化[76]。衣霉素对GAP-43、N型Ca2+通道、雌激素受体α变体和髓鞘脂质蛋白的棕榈酰化均有抑制作用[73,76—78]。
4.3 蛋白质棕榈酰硫酯酶脱棕榈酰化
使用蛋白棕榈酰硫酯酶将棕榈酰化蛋白脱棕榈酰化是抑制棕榈酰化蛋白质的另一种方法。酰基蛋白硫酯酶1(Acyl Protein Thioesterase 1, APT1)和棕榈酰基蛋白硫酯酶1 (Palmitoyl Protein Thioesterase 1, PPT1)催化棕榈酸盐从蛋白质Cys脱离[79]。APT1已被证明可使eNOS、Gαs和H-Ras脱棕榈酰化[80—82]，它参与调节体内可见的细胞质蛋白的可逆S-棕榈酰化。PPT1参与S-棕榈酰化蛋白的溶酶体降解， PPT1缺陷将引起婴儿神经元蜡样脂褐素沉着病[78]。
5 棕榈酰化对非生物胁迫的应答
非生物胁迫是指在特定环境下，非生物因素对植物造成的不利影响，如干旱、洪涝、盐碱、矿物质缺乏等。研究表明，翻译后机制在非生物胁迫反应中发挥重要作用[83]。植物对非生物胁迫反应的部分应答由CBL1介导[84—85]，且CBL1在3th Cys上被S-棕榈酰化；钙依赖性蛋白激酶(CPKs)是与非生物胁迫信号相关的钙敏感激酶，在其N末端的半胱氨酸残基被S-棕榈酰化[86]。Vats等[87]发现棕榈酰化对于调节与干旱胁迫相关的蛋白质的活性至关重要，并首次报道了大量与干旱胁迫相关的蛋白质可能
受棕榈酰化作用的显著影响。作者用棕榈酰化抑制剂2-溴棕榈酸处理生菜Lactuca sativa var. ramosa种子，这些种子在低温条件下有较高的发芽率，初步认为2-溴棕榈酸在低温条件下对种子起保护作用(数据待发表)。
6 展望
蛋白质的棕榈酰化可以调节蛋白质的定位、转运和运输，还有许多棕榈酰化的生理功能值得去探究。从酵母到哺乳动物中已发现上百种棕榈酰化蛋白，但是其具体功能和底物尚不明确，仍需进一步挖掘。目前也发明多种检测蛋白质棕榈酰化修饰位点的方法，使得对蛋白质棕榈酰化的研究取得较大进展，但是现有大多数棕榈酰化蛋白的具体棕榈酰化修饰位点还不明确，还需要结合各种方法对其进行定性和定量分析。除此之外，蛋白质棕榈酰化的研究还存在较多挑战：(1)PAT介导了蛋白质的棕榈酰化，但其介导机制尚不清楚；(2)PPT和PAT分别介导蛋白的脱棕榈酰化和棕榈酰化，它们在表达调控上是拮抗还是协同，或是互不影响，需要进一步研究；(3)蛋白质的棕榈酰化在生物应激和胁迫反应方面是否发挥作用也研究甚少。以上问题是蛋白质功能研究的重要方面。作者实验室研究发现2-溴棕榈酸在低温冷冻条件下对含水种子起保护作用，接下来将对其分子机制进行研究，探究在种子的抗冻机制中发挥作用的基因或蛋白。对蛋白棕榈酰化的深入研究不仅可以加深对蛋白质组学的认识，还可以为某些疾病的诊断和提供新的借鉴。
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