第49卷第7期2021年4月
广州化工
Guangzhou Chemical Industry
Vol.49No.7
吴志文，张振涛
(内蒙古医科大学，内蒙古呼和浩特010110)
摘要：一氧化氮(NO)在许多生理病理过程中起着至关重要的作用，在各种分析NO方法中，基于荧光探针的图像技术由于其高灵敏度，无创性和可视化的独特优势被认为是理想的检测方法。本文对邻苯二胺、芳香仲胺、二氢毗睫等有机物NO荧光探针和铜(II)、铁(III)的金属络合物的NO荧光探针，在合成设计、灵敏度、选择性及在体内外实时定量检测外源性和内源性NO 的应用，进行了综述介绍。
关键词：一氧化氮；荧光探针；有机物；金属络合物
中图分类号：R914.5文献标志码：A文章编号：1001-9677(2021)07-0017-05 Research Progress on Fluorescent Probes for Detection of NO
WU Zhi-wen,ZHANG Zhen-tao
(Inner Mongolia Medical University,Inner Mongolia Hohhot010110,China)
Abstract:Nitric oxide(NO)plays a crucial role in many physiopathological processes,and among the various methods for NO analysis,the image technique based on fluorescent probes is considered ideal due to its unique advantages of high sensitivity,noninvasivenessand visualization.The application of NO fluorescent probes for organic NO such as o-phenylenediamine,aromatic secondary amines,and dihydropyridine and NO fluorescent probes for metal complexes of copper(II)and iridium(III)in terms of synthetic design,sensitivity,selectivity,and real-time quantitative detection of exogenous and endogenous NO in vitro and in vivo were reviewed.
Key words：NO；fluorescent probes；organic matter；metal complexes
一氧化氮(NO)是一种重要的气体分子，是通过三种不同的一氧化氮合酶(内皮型一氧化氮合酶eNOS；神经元一氧化氮合酶nNOS；诱导型一氧化氮合酶iNOS)将L-精氨酸转化为瓜氨酸而产生的⑴。从生理
学上讲，NO是一种内源性的表皮舒张因子，可刺激血管平滑肌舒张，并且还充当神经递质和免疫系统中的抗感染分子，以抵抗感染。从病理上讲，NO与稳态障碍发作有关炉勺。由于其明确的意义，开发用于实时追踪生物系统中NO水平的灵敏方法和工具，对于人类的健康至关重要。在过去的几十年中，电化学，电子顺磁共振，化学发光，比法和荧光法等许多分析技术已被用于检测不同环境下的NO15-111o在这些方法中，基于荧光的生物成像方法因其出的灵敏度和选择性，高分辨率，无创性，广泛的被用于NO的检测，目前，已经开发出用于检测NO的各种小分子荧光探针。特别是在过去的五年中，已经报道了各种具有改善的荧光性质和传感能力的NO荧光探针，其中一些在监测生物系统中的外源性和内源性NO方面显示出巨大的潜力。本综述总结了近年来报道的新型NO荧光探针。讨论了釆用不同NO识别基团和方法的有机物和金属配合物荧光探针，以及它们在体外和体内实时定量检测外源性和内源性NO的应用。
通常，基于有机物的NO荧光探针通常包含两个关键元素，即NO识别位点和荧光团。NO识别位点可以与NO发生特异性化学反应，并激发荧光团发生特异性发性，起到捕捉NO的作用，很多官能团可以用作NO识别位点，例如邻苯二胺，可以与NO发生环化反应，生成苯并三哩；二氢毗®(Hantzsch酯)，可以与NO发生氧化反应，将二氢毗睫芳构化；芳香族仲胺，可以与NO反应，生成N-亚硝产物。为了实现NO探针的细胞器靶向能力，还会配备一些官能团作为递送载体，以将探针特异性地运输到细胞器，如带正电荷的三苯基麟可以靶向到线粒体，带弱碱性吗咻可以靶向溶酶体。
1基于有机物的NO荧光探针
1.1基于邻苯二胺环化的荧光探针
由长野研究小组最早开发的基于邻苯二胺的NO荧光探针是生物系统中NO检测最广泛使用的探针［5'12-17］。在没有NO 的情况下，将发生从富电子的邻苯二胺基团到荧光团的光致电子转移(PET)过程，以猝灭荧光。在富氧条件下与NO反应后，富电子的邻苯二胺部分可以转化为吸电子的苯并三哩环，从而阻断PET过程并激发荧光团，从而提供可检测的荧光发射。
2016年，Chen J B等悶将邻二胺基苯基连接到了3,5-(2-释基苯基)-二亚甲基毗咯上，首次合成了硼螯合荧光探针(BOPB)(图1)，该探针在622/643nm的最大激发/发射波长下，可以敏感且选择性地响应，并且可以用于小鼠肝脏中的世界湿地大会
第一作者：吴志文(1995-)，男，内蒙古医科大学硕士，从事药物化学研究。
通讯作者：张振涛(1961-)，男，内蒙古医科大学教授，主要从事药物化学、有机化学的研究。
18广州化工2021年4月
NO的检测。与之前报道的用于确定NO的荧光探针方法相比,
该方法具有更长的检测波长（675nm），最短的衍生时间
（12min）和最低的LOD（0.02nM）。
图1BOPB探针对NO的传感机制
Fig.1Sensing mechanism of probe ROPD for NO
NO
图4探针2对NO的传感机制
Fig.4Sensing mechanism of probe ROPD for NO
同年，FengW等网合成了一种基于1,8-荼甲酰亚胺的邻苯二胺荧光探针LysoNONaph（图2），用于对溶酶体中的NO进行成像。该探针在pH值为3.8-12的范围内不敏感，对NO的选择性高，灵敏度低，检出限低至4.57mmol/L，因此可以用于细胞溶酶体成像。
同年，WangQ等冋合成了一种选择性和灵敏的阳离子荧光探针（ROPD）（图5），该探针以邻苯二胺基作为反应位点，以罗丹明作为荧光团。该探针在宽pH范围内在水相中显示出对NO的高选择性和
灵敏度，并具有快速响应。同时，探针ROPD可以透过细胞膜，可用于实时观察L929和HeLa细胞中的外源NO，以及应激的RAW264.7细胞中的内源性NO。河流 电影
图5ROPD探针对NO的传感机制
Fig.5Sensing mechanism of probe ROPD for NO
图2LysoNONaph探针对NO的传感机制
Fig.2Sensing mechanism of probe LysoNONaph for NO
2018年，Zhang J等㉔通过将邻苯二氨基与BODIPY染料相连接，成功设计出了一种用于检测NO和亚硝酸盐的双响应式荧光探针1（图3）。该探针本质上由于PET效应而不会发荧光，但是在中性条件下用NO处理或在酸性环境中用亚硝酸盐处理时，探针会迅速变为高荧光状态，具有高选择性和低检测限。在细胞成像实验中，使用DEA・NONOate作为NO的源并在细胞内Cys和GSH的辅助下，探针1可以观察到蓝荧光。
2019年，Jiang WL等㉔合成了dRB-OPD的荧光探针（图6）并用于识别NO。该探针以邻苯二胺基作为反应位点，以脱氧罗丹明B作为荧光团。dRB-OPD显示40秒钟内对NO的快速响应，荧光增强170倍。此外，该探针相对于脱氢抗坏血酸（DHA），抗坏血酸（AA）和甲基乙二醛（MG0）表现出对N
O的高选择性。特别地，该探针可以避免来自若丹明内酰胺基荧光NO探针（RB-OPD）中发现的半胱氨酸（Cys）的严重干扰。可以用于检测HepG2和RAW264.7细胞中的外源性和内源性N0o
dRB-OPD
9Fast response(<40s)
no/o2
•High specificity
丿
dRB-OPD-NO
图3探针1的合成及探针1对NO的预期传感机理Fig.3Synthesis of probe1and expected sensing mechanism
of probe1for NO
同年，ZhaoQ等a设计并合成了一种在侧链上具有邻苯二氨基的新型水溶性共辄聚合物（PBFB-PDA-
NMe；）荧光探针2（图4），该探针仅孵育15分钟即可快速成像显示A549细胞和金黄葡萄球菌细菌的细胞内NO，并且该探针具有很高的选择性，可以将NO与其他反应性物种（如NO],NO,H2O2, GSH，半胱氨酸和抗坏血酸）区分开来。因此可以用于内源性NO的超快速，灵敏和选择性检测。
图6dRB-OPD探针对NO的传感机制
Fig.6Sensing mechanism of probe dRB-OPD for NO
1.2基于芳族仲胺N-亚硝化的荧光探针
基于芳族仲胺N-亚硝化的荧光探针对NO的检测具有完美的选择性，因为由于仲胺基团的电子密度控制，与基于邻苯二胺类的荧光探针不同，该探针不受其他活性氧发生反应/氮物种（RNS/ROS）和活性按基物质（RCS）物质的干扰。此外，芳族仲胺与各种金属离子的配位能力较低，这对于其高选择性也至关重要。
2017年，MaoZ等设计了一种基于芳香族仲胺的N-亚硝化的新型荧光探针NCNO（图7），探针NCNO可以在ROS, RNS和RCS之间以明显的选择性和灵敏度识别NO。由于其双光子激发和红光发射，可以检测到活细胞和深层组织中的NO。该探针还首次被用于监测缺血再灌注损伤（IRI）小鼠肾脏中的N0
o
第49卷第7期吴志文，等：检测一氧化氮的荧光探针研究进展
19
图7 NCNO 探针对NO 的传感机制
Fig. 7 Sensing mechanism of probe NCNO for NO
荧光极大地打开，并显示出高的选择性和对NO 的敏感性。检
测限为18 nM o 细胞毒性试验证明DHPS 和PYS 都是生物相容 的，DHPS 已被成功应用于追踪RAW 264. 7细胞中内源性产生
的NO 。
图10 DHPS 探针的结构
Fig. 10 The structure of probe DHPS
2019年Huo Y 等［⑸合成了一种芳香族仲胺N-亚硝化的探
针1及可靶向线粒体的衍生物探针Mitol （图8），作为荧光NO 探针，该用于区分Ml 巨噬细胞和M2巨噬细胞的诱导型NO 合 酶（iNOS ）水平差异。这两种探针具有独特的能力，能够同时响 应NO 的两种二次氧化物，即和0N003，因此，与大多
数通常仅响应的现有荧光NO 探针相比，反映细胞内的 NO 更加敏感和可靠。进一步表明该探针在癌症免疫疗法研究 和相关的抗癌药物筛选中成像的应用潜力。
图8探针1和Mitol 探针对NO 的传感机制82RCC.
Fig. 8 Sensing mechanism of probe MiTol and probe 1 for NO
2018年，Gao C 等朗 通过将二氢毗I®和三苯基麟（TPP ）部
分引入到硼联毗® （BODIPY ）染料中，设计并合成了用于一氧
化氮（NO ）的线粒体靶向探针M i to-DHP （图ll ）o Mito-DHP 通 过在无氧条件下将二氢毗喘芳构化为荧光毗睫产物，可以有效 地检测一氧化氮。Mito-DHP 探针对多种活性氧/氮（ROS/ RNS ）表现出对NO 的高选择性，以及高灵敏度（25 nM 的检测 限），pH 稳定性和生物相容性。
1.3基于二氢毗唏氧化的荧光探针
二氢毗©（Hantzsch 酯）可以被NO 定量氧化，以平稳地提 供相应的毗睫部分。因此，二氢毗睫基团可以用作NO 捕获基 团，用于开发新型荧光探针。更有趣的是，二氢毗睫与NO 的 反应可以在厌氧环境下进行，这将明显提高荧光探针对NO 的
选择性。
赵总理
2016年，MaSF 等公】合成了由7-甲氧基香豆素（作为荧
光团）和二氢毗睫衍生物（作为NO 的受体）组成DHP-1荧光探 针（图9），用于检测NO 。探针DHP-1的光学特性和活细胞成 像显示出对NO 的快速响应，其荧光强度比背景增强了 80倍,
并且对NO 的选择性高于其他活性氧或氮。DHP-1探针还可用 于在生物学相关pH 范围内检测活细胞中的NO 。
图11 Mito-DHP 探针对NO 的传感机制
Fig. 11 Sensing mechanism of probe DHP-1 for NO
1.4其他类型的有机基NO 荧光探针
2014年，Xin Lv 等凶通过将特定的NO 识别基团2-氨基-
3-二甲基氨基联苯连接到Bodipy 染料中，构建了荧光探针3
（图12），该探针该探针可以选择性地检测ROS/RNS 和AA/ DHA/MGO ±的NO，检测限低至30 nM 。将细胞用该探针预处 理1小时并与DEA • NONONOate （50 mM ） W 育1 h 后，可以观 察到细胞中强烈的荧光。这些结果证实了探针1具有可视化活 细胞中NO 水平的潜力。
DHP-1
PY-1
Weakly fluorescent
Strongly fluorescent
M
2
图12探针3对NO 的传感机制
Fig. 12 Sensing mechanism of probe ROPD for NO
图9 DHP-1探针对NO 的传感机制
Fig. 9 Sensing mechanism of probe DHP-1 for NO
同年，Wang H L 等切合成了香豆素的水溶性二氢毗睫的
多媒体光盘制作衍生物DHPS （图10），并将其成功应用于水溶液中的荧光传感
一氧化氮（NO ）。DHPS 探针的荧光极弱，而加入NO 溶液后其
2019年Liu Y 等⑶］合成了基于花青染料（Cy7）的荧光探针
（图13），用于通过在Cy7染料的内消旋位置上连接甲基氨基来 检测NO 。由于分子内的电荷转移过程，该探针在800 run 处显 示微弱的荧光发射，而用NO 处理后，该探针迅速变成高度 NIR 荧光状态。检测限低至11. 3 nM 。该探针对NO 的选择性超 过活性氧，活性氮和金属离子。更重要的是，该探针对NO
的
20广州化工2021年4月
荧光反应发生在生理上有利的NIR区域，从而使其能够进一步用于在背景干扰低且穿透深度较深的发炎小鼠模型中对内源性NO成像。
图13Cy7-MA探针对NO的传感机制
Fig.13Sensing mechanism of probe Cy7-MA for NO
同年，Fu YL等⑶］开发了一种新型荧光探针8-HB(图14)，该探针以BODIPY作为荧光团，并以8-取代的腓为活性部位来检测NO。探针8-HB可以与N0/02反应生成荧光脱水的BODIPY，并伴有少量的8-叠氮化物B0DIPY o8-HB具有出的灵敏性(LOD二22nM)。此外，8-HB具有很低的细胞毒性和良好的生物相容性，并能在活的HepG2细胞中选择性地检测NO活性氧/氮物种(0N00\H2O2和C10-)并检测活体RAW264.7细胞内源性NO。
切史n3和哌嗪单元作为刚性间隔基，并通过FRET机制在7-轻基香豆素和荧光素生团之间进行能量转移。这两种探针通过其对生理pH值下对NO的敏感，直接和选择性的比例响应，并使它们具有增强的细胞渗透性和亚细胞定位功能。
2.2基于B(III)配合物的NO荧光探针
稳定的铁(III)配合物由于其强而长寿命的荧光发射，也可以用作基于金属络合物的荧光团。可以引入一个NO识别基团来激发PET过程并猝灭荧光，从而提供另一种基于金属配合物的NO探针。
Wu C等⑶］设计并合成了一种长寿命的发光錶(III)配合物探针1(图16)，用于监测从硝普钠(SNP)可控释放的NO。探针1在580nm处存在SNP时显示15倍的开启发光。探针对SNP的线性响应在5~25|jl M之间，检测极限为0.18|xM o重要的是，证明了HeLa细胞中NO的发光开关检测。
图16錶(III)探针对NO的传感机制
Fig.16Sensing mechanism of probe Iridium(III)for NO
图148-HB探针对NO的传感机制
Fig.14Sensing mechanism of probe8-HB for NO
2基于金属配合物的荧光探针
使用胺作为识别基团的大多数NO荧光探针可以通过环化或N-亚硝化反应间接检测N0o尽管这种类型的探针显示出有限的实用性，但由于间接检测策略始终受到生物学环境的干扰。相比之下，基于金属配合物的荧光探针可以直接检测NO，并克服了生物系统中背景信号的干扰。此外，基于金属配合物的荧光探针具有出的光稳定性和大的斯托克斯位移，可发出强而长寿命的荧光发射。
2.1基于铜(H)配合物的NO荧光探针
基于Cu(II)的配合物是开发NO荧光探针的理想选择。Cu (II)中不成对的电子与配体配位后，可以猝灭荧光团产生的荧光。但是用NO处理后，Cu(II)平稳地转化为Cu(I)，从而使淬灭作用消除，荧光恢复。
C u(FL3A-P9K-CC)Cu(FL3A-Ppz-CC)
图15Cu(II)探针对NO的传感机制
Fig.15Sensing mechanism of probe Cu(II)for NO
2017年，ALoas等［珂设计了两种新的基于Cu(II)的探针(图15)，用于一氧化氮的检测。传感器分别采用聚脯氨酸螺旋3结语
近年来报道的用于在生物系统中对NO成像的各种荧光探针。大部分还是基于有机物的NO荧光探针，基于金属络合物的NO荧光探针很少，这些探针显示出高选择性和灵敏度，低细胞毒性和深层的组织穿透能力，非常适合在体外和体内对NO成像。但是，同样也存在浓度低，半衰期短和扩散特性快等缺点，因此开发出能够准确分析生物系统中NO的荧光探针仍然是科学家面临的巨大挑战。
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