南京农业大学学报2021，44(3):457-467nauxb.njau.edu
Journal of Nanjing Agricultural University D01:10.7685/jnau.202006044 I
张雅芬，刘亚琴，蒋明义.水稻bip130与0SA7蛋白互作的验证及bip130对质膜U+-ATPase活性的影响[J].南京农业大学学报,2021,44(3): 457-467. ZHANG Yafen,LlL Yaqin,JlANG M ing^r i. Identification of the interaction between bip130 and 0SA7 and the effect of bip130 on plasma membrane U+-ATPase activity in rice[J]. Journal of Nanjing Agricultural Lniversitv,2021 ,44(3) ：457-467.
水稻bipl30与OSA7蛋白互作的验证及bipl30
对质膜H+-ATPase活性的影响
张雅芬，刘亚琴，蒋明义*
(南京农业大学生命科学学院，江苏南京210095)
摘要：[目的]本文旨在验证水稻中bip130(油菜素内酯受体蛋白B R11互作蛋白130)与0S A7(质膜H+-AT
P酶7)的相互作用以及A BA处理下bip130对水稻根部质膜H+-ATPase活性的影响。[方法]采用酵母双杂交技术（Y2H)、萤火虫荧光素酶互补成像系统（L C l)、GST pull-dow，n、双分子荧光互补技术（B iF C)验证bip130与0S A7是否相互作用，并用Y2H与LC1验证bip130与0S A7相互作用的区域以及bip130与0S A7同源蛋白的关系。利用RT-qPCR分析A BA处理时6ip i30与OSA7 的上、下游关系。利用6ip i30突变体通过水稻原生质体瞬时表达体系检测bip130对0S A7活性的影响。[结果]bip130与0S A7的胞质N结构域相互作用，不与5个同源蛋白的胞质N结构域互作。A B A信号途径中6ip i30位于0S A7的上游；突变体分析结果显示，6i p«0过表达进一步增强A BA诱导的质膜H+-ATPase活性，而6ipi30-flNAi阻止A BA诱导的质膜H+- A TPase活性增加。原生质体瞬时表达结果显示在A B A信号途径中bip130可以调控质膜H+-ATPase活性。[结论]bip130 与0S A7的胞质N结构域相互作用，且bip130参与调控A BA信号途径中质膜H+-ATPase的活性。 关键词：bip130;0SA7；蛋白互作;A BA；质膜H+-ATPase活性
中图分类号：Q945 文献标志码：A 文章编号：1000-2030(2021) 03-0457-11 Identification of the interaction between bipl30 and OSA7 and the
effect of bipl30 on plasma membrane H+ -ATPase activity in rice
ZHANG Yafen，L1U Yaqin，J1ANG Mingyi*
对流层(College of Life Sciences，Nanjing Agricultural University，Nanjing 210095，China)
A bstract：[0bjectives]This paper was aimed to conlir^n the interaction between bip130( BR11-interacting protein 130) and 0SA7 (plasma membrane H+-ATPase 7)and verify that bip130 could regulate the activity of plasma membrane H+-ATPase in rice roots under ABA treatment. [Methods] Yeast tw，o-hybrid technology (Y2H)，firefly luciferase complementary imaging system (L C1)，GST pull-dow，n and bimolecular fluorescence complementary technology (
B iFC) "w ere used to verify "whether bip130 interacts "w ith0SA7. Then，Y2H and LC1 had been used to identify the interaction region between bip130 and 0SA7 and the relationship between bip130 and 0SA7 homologous proteins. RT-qPCR had been used to analyze the upstream and downstream relationship between bip130 and 0SA7 under ABA treatment. The bip130 mutant materials have been used in the rice protoplast transient expression system to detect whether bip130 could affect the activity of plasma membrane H+-ATPase. [ Results] The results indicated that bip130 interacted with the cytoplasmic N-domain of 0SA7，but did not interact with the cytoplasmic N-domain of these five homologous proteins. 1n the ABA signaling pathway，bip!30was located in the upstream of 0SA7.Mutant analysis showed that bip!30overexpression could further enhance the activity of ABA-induced plasma membrane H+-ATPase，while bip!30-RNAi prevented t
his process. The analysis of the protoplast transient expression system indicated that bip130 could regulate the activity of plasma membrane H+-ATPase in the ABA signaling pathway. [ Conclusions] bip130 interacted with the cytoplasmic N-domain of 0SA7 and bip130 participated in the regulation of plasma membrane H+-ATPase activity in ABA signaling pathway.
Keywords ： bip130 ； 0SA7 ； protein-protein interaction ； abscisic acid( ABA) ； plasma membrane H+ -ATPase activity 植物响应逆境胁迫的有效途径之一为胞内ABA的迅速累积，从而引起一系列的抗逆反应，例如气孔 开闭、叶片扩张速度下降、细胞渗透势降低等[1-2]。研究发现,ABA参与质膜ATP酶和液泡膜ATP酶的修 饰过程[3]，可以为离子的逆向转运蛋白提供更多驱动力。质膜H+-ATPase是广泛存在于植物中的一种膜收稿日期：2020-06-25
基金项目：国家自然科学基金项目（31471427)
作者简介：张雅芬，硕士研究生。*通信作者：蒋明义，教授，博导，研究方向为植物逆境生理与分子生物学，E-mail:******************.cii
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蛋白。它可以水解A T P产生能量，把H+从细胞内栗出到膜外，使细胞外积累大量正电荷，与细胞内
的大 量负电荷形成跨膜电化学势梯度，为离子的跨膜运输提供能量来源[4]。H+-A T P a s e属于P型A T P酶，由1条多肽链组成，相对分子质量约为l x l O5，拥有10个跨膜螺旋构成的M-结构域，以及A-、P-、N-、R-这 4个胞质结构域。植物对胁迫的耐性提高与植物的质膜H+-A T P aS e活性增强有关。例如：盐胁迫下质膜 H+-A T P a se转运H+使细胞膜内外的质子浓度梯度改变，让N a+/H+逆向转运蛋白体将细胞内过多的N a+栗 出细胞[5]，从而减轻盐胁迫对植物细胞的伤害。质膜H+-A T P aS e活性会影响一些生理过程，例如：细胞扩 张、营养吸收、营养易位、糖易位、气孔控制和激素流动等[6-9]。
水稻质膜H+-A T P aS e共有10个同源蛋白，O S A7为其中之一。研究表明，0別7在所有同源基因中表 达最高，且对气孔的开放有很大影响；。突变体会表现出严重的生长缺陷，在生殖期到达前就会枯 萎[|0-||]。这些结果说明O S A7在水稻中起着至关重要的作用。biP130最初是由H ira b a y a sh i等[|2]从水稻 c D N A文库中筛选到的可能与油菜素内酯（B R)受体B R I1互作的蛋白。目前关于l)iP130的报道甚少，本 实验室对l)iP130进行研究后发现,A B A可诱导水稻中的表达，l)iP130参与A B A诱导的抗氧化防护 途径[13];1：如130与促分裂原活化蛋白激酶O sM P K1相互作用[14]，而M A P K家族基因广泛参与植物的胁迫 响应过程[15]；为了进一步探究b i p130参与植物胁迫响应的作用机制，本实验室前期利用酵母双杂交技 术，以l)ip130为诱饵筛选到水稻中可能与l)ip130相互作用的靶蛋白O S A7。然而，酵母双杂交试验具有假 阳性。本研究使用多种方法从体内外验证b ip130与O S A7相互作用的真实性，并出b i p130与O S A7相 互作用的区域以及A B A信号通路下6中7邓与0別7的上、下游关系， 纳什均衡解最后探究b ip130是否会调控质膜H+- A T P a s e的活性，旨在为胁迫条件下b i p130的作用机制研究提供理论基础。
1材料与方法
1.1材料
蛋白互作试验的植物材料：梗稻（0?yza sahW L.)品种‘日本晴’、本生烟(Nicotiana benthamiana)。‘日本晴’、叫7见-0五过表达材料以及'干扰材料用于检测质膜H+-ATPase活性以及RT-qPCR。
1.2酵母双杂交试验（Y2H)验证蛋白互作
根据pGADT-7图谱和OSA7序列选择母n I和B am H l酶切位点构建0S/47-pGADT-7重组载体。分 别将0&47-pGADT-7和bipD0-pGBKT-7转人酵母Y187和Y2H细胞，于SD-Leu/-Trp上融合培养后，转接 到SD-Leu/-Trp液体培养基中振荡培养。收集菌液后滴定到SD-Trp/-Leu/-His/-Ade/X-a-g a l四缺培养基上观察菌落是否变蓝。
1.3萤火虫荧光素酶互补成像系统试验(L C I)验证蛋白互作
根据0似7序列和pCAMBIA1300-nLUC载体图谱选择fi a m H l和滅M I酶切位点构建重组载体。将 pCA
MBIA1300 :nLUC-bipD0 和 pCAMBIA1300 :0&47-nLUC转人 GV3101 农杆菌后液体培养 16〜24 h，收集 菌液，调整浓度，按体积比 1 :1 :1 将 PCAMBIA1300 :(:LUC-bipD0、pCAMBIA1300 :0&47-nLUC 以及 P19 菌液混合后侵染烟草叶片。暗培养24 h后，光照培养2~3 d，喷荧光素酶底物避光反应30 min后，用光学成 像仪Tanon5200观察荧光。
1.4谷胱甘肽转移酶下拉试验（GST pull-down)验证蛋白互作
根据0別7序列和pET-30a载体图谱选择Xpn I和ffin d瓜酶切位点构建重组载体。原核表达并纯化 OSA7-N-His、OSA7-C-His 以及 bip130-GST蛋白，将纯化好的 GST-bip130 蛋白结合到 MagneGST™珠子上，分别加人靶蛋白OSA7-N-H is和OSA7-C-His，在垂直旋转仪上4丈反应1h。以只含有GST-bip130的MagneGSTT M珠子和携带GST空载体的MagneGST™珠子为对照。反应终止后用漂洗缓冲液清洗珠子，使 用His抗体进行检测。
1.5双分子荧光互补试验（BiFC)验证蛋白互作
根据0似7序列以及pSPYNE载体图谱选择母n I和B a m H l酶切位点构建重组载体。将培养14 d 的水稻幼苗的茎部切成小段放人酶解液，抽真空后黑暗低速旋转4 h左右，收集水稻原生质体，在显微镜 下观察并计数，将水稻原生质体稀释至（1〜2) x106mL-1。将pSPYCE-bipDO与pSPYNE-0S/47重组质粒 共同转人水稻原生质体，25丈暗培养12〜16 h后，将细胞置于激光共聚焦显微镜下观察荧光。
第3期张雅芬，等：水稻bipl30与0SA7蛋白互作的验证及bipl30对质膜H+-ATPa Se活性的影响459
1.6双链R N A的体外合成与纯化
在0&47的C D S区选择约200 b p的片段作为dsRNA模板，使用RiboMAX™Large Scale RNA Production System-T7试剂盒（Promega)合成dsRNA。加人等体积的酚和氯仿抽提并纯化，使用RNA-free 水溶解后于紫外分光光度计检测浓度。
1.7原生质体分离及P E G介导转化
参照Zhang等[16]的方法，提取3叶期的水稻幼苗原生质体：茎部切成约0.5 mm的小段，放人酶解液 中黑暗抽真空1h后，黑暗慢速摇4 h；过滤酶解后的混合液，室温下150 g•离心5 min，去上清液；用原生质 体洗涤液悬浮后,150 g离心5 min，去上清液；取适量原生质体溶液滴在血球计数板上，观察原生质体状态 和数量；用W5溶液稀释原生质体至（1〜2)x106mL—1。取500 +L稀释好的原生质体加人50 P g重组质 粒，混合均勻；加人等体积的40%PEG溶液，缓慢混合均勻至无丝状，室温黑暗培养15 min后，加人9倍 体积培养溶液，室温静置5 min,150 g离心3 min；弃上清液，加人500 p L培养液重新悬浮，室温下150 g 离心3 min；弃上清液，转移到用小牛血清润洗过的细胞培养板中,28丈黑暗培养12〜16 h。
1.8水稻总R N A提取及cDNA合成
参照Zhu等[|7]的方法，将水稻根部加液氮研磨至粉状后加人预冷的600吣Trizol试剂充分混勻，冰 浴5〜10 min；加人200 p L氯仿混勻，冰浴5 min;4丈、12 000 r.min-1离心10 min；取400 p L上清液，转人 新的1.5 mL E P管中；加人等体积的异丙醇，充分混勻后冰浴30 min;4丈、12 000 r，min_1离心10 min，弃 上清液；加人400 pL75%乙醇洗涤沉淀,4丈、12 000 r.min-1离心5 min；弃上清液，加人20 pL DEPC溶解 总RNA，利用Prime Script™反转录试剂盒（TaKaRa)进行反转录后得到cDNA。
1.9 实时荧光定量PCR
在美国国家生物信息中心网站（NCBI)bi.v查询0&47及其同源基因的序列，用Primer Premier6设计特异性引物（表1)。参照TaKaRa SYBR G reenI的说明书进行实时突光定量 PCR(RT-qPCR)。总体系为 20 pL：正、反弓|物各 0.4 pL,2xSYBR& 7^ 10 pL,50xR0X Reference
D y e l0.4 pL,cDNA模板 1pL,DEPC水 7.8 pL。反应程序：95 T；30 s;95 T；5 s,60 T；34 s,95 T；15 s,
40 个循环;60 T；1min;95 T；15 s。
表1实时荧光定量P C R所用引物
Table 1 T h e primers used to quantitative real-time P C R
引物对名称引物对序列
Prim er pairs nam e Primer pairs sequence(5，^3，)
引物对名称引物对序列
Prim er pairs nam e Prim er pairs sequence(5'—3')
0^47-F/R AGAGCCGGTATCAGGGAAGT/CACAGGGTCAGGATCTGCTC
0&4/-F/R TGGGCACATGCACATAGGVGCTCACTGTAGCCGGTCTTCTC
0^42-F/R GCAGAAGAGGCCCGTAGGA/CAGGGTGGTCAGCTCTCTCAA
0^43-F/R AATTCTGCAATCACCTACGTGTACTT/GCTGGAGCAGGAGGGACAA 0辦-F/R CGTCGAGTCGGTGGTCAAG/CGGTGTAGTGGTTCTGGATGGT
0M5-F/R CGGCGTCATCTGGCTCTAC/GACGGCGAACTTGAAGATGTC
br715TAGCGGCGAGGCACAACA/TGGCGGCTTCCTTTCATA
Actin-F/R GGTCCTCTTCCAGCCTTCCTTCVCACCACTGAGAACGATGTTGCCATA
1.10 A B A处理下基因表达检测
将野生型‘日本晴’水稻培养至3叶期后，选取长势一致的幼苗，去伤害处理4 h后用100 pmol•L-1 ABA处理水稻幼苗，分别于0、15、30、60、90、120、180和240 min迅速取样，以同等条件下超纯水处理的幼 苗作为对照组。提取样品的RNA并反转为cDNA后，进行荧光定量PCR检测0別7基因表达。以y S-aC t a'r a 作为内参，将处理0 min时的相对表达水平作为1。
1.11 0S47瞬时表达与干扰效果的检测
容县公社论坛利用PEG介导转化法将合成的0別7 dsRNA以及pXZP008-0別7瞬时转人水稻原生质体中，以同等 条件下转人ddH20作为对照组。提取RNA，反转为cDNA后，通过RT-qPCR检测dsRNA的干扰效果以及 瞬时转化pXZP008-0似7后0別7基因的表达情况。
1.12吨J刈与仍47的上、下游关系检测
以野生型‘日本晴’»7邓过表达突变体以及干扰突变体为材料，用100 pmol.L-1ABA处理 30 min后取样，以同等条件下ddH20处理幼苗作为对照，提取RNA并反转为cDNA后，通过RT-qPCR分 析不同材料中0似7的表达差异；利用原生质体瞬时表达体系，在水稻原生质体中瞬时过表达和沉默 0別7，过夜培养后用10 pmol.L-1ABA处理5 min，以瞬时转人ddH20作为对照组。提取RNA并反转为 cDNA后，通过RT-qPCR分析不同处理中的表达情况。
460南京农业大学学报第44卷
1.13质膜H+-ATPase活性测定
参考L arss〇n等[18]的两相分离法提取和纯化水稻叶片质膜蛋白：取适量水稻根部，加人2倍体积预冷 的研磨缓冲液，磨成匀浆后用4层纱布过滤，4°C、5 000 g离心10 m i n；取上清液，4°C、60000 g离心 30 m i n；去上清液，用悬浮缓冲液重悬沉淀，加人6.3%的二相系统，上下摇匀40次后，4°C、4 200 g离心 5 m i n；取上相和下相继续进人二相系统，分离3次后合并上相，稀释3〜5倍;4°C、60 000 g离心30 m i n；取 沉淀，加人悬浮缓冲液悬浮，参考B m d f o r d[19]的方法测定水稻质膜蛋白含量。
水稻质膜H+-A T P a Se的活性测定参考O h n i s h i等[20]的方法:50吣质膜微囊加人0.5 m L反应液，放人 37C水浴30 m i n后，加人0.5 m L 10%S D S溶液终止反应，补水至3 m L后，加人3 m L显液，混匀，放人 37C水浴保温20 m i n，测定波长660 n m处的吸光值，计算无机磷含量。
2结果与分析
2.1 bip130与OSA7互作关系的验证
酵母双杂交试验结果如图1-A所示，在S D-T r P/-L eu/-H i s/-A d e/X-a-g a l四缺培养基上，试验组O S A7-A D/b i p130-B D和阳性对照p G B K T-7-p53/p G A D T-7呈现出蓝菌落，阴性对照p G B K T-7-l
a m/p G A D T-7和 O S A7-A D/B D、A D/b i p130-B D在四缺培养基上没有生长。结果说明在酵母中O S A7与b i p130相互作用。
G S T p u l l-d o w n试验结果如图1-B所示，O S A7-N-H i s蛋白和G S T-b i p130蛋白相互作用形成了复合蛋白，可 以通过W e s t e r n blot试验检测出O S A7-N-H i s的条带，而G S T空载蛋白不能与O S A7-N-H i s或O S A7-C-H i s 结合，无法显示出条带，即证明了 O S A7的N端与b i p130在体外存在相互作用。
图1酵母双杂交试验（A)和谷胱甘肽转移酶下拉试验（B)验证b i p130与O S A7的相互作用Fig. 1 Yeast two-hybird( Y2H,A)a n d G S T pull-down(B) assay of the interaction between bip130 a n d O S A7
L C I试验结果如图2-A所示：在阳性对照O s D M I3-c L U C+O s P P45-n L U C和试验组b i p130-c L U C+O S A7-n L U C共侵染的烟草部位观察到较强的荧光，而阴性对照O S A7-n L U C+c L U C和n L
U C+b i p130-c L U C没有荧 光。这说明b i p130与O S A7在烟草内存在相互作用。以水稻原生质体为材料，利用B i F C技术验证b i p130
图2萤火虫荧光素酶互补成像系统试验（A)和双分子荧光互补试验（B)体内验证b i p130与O S A7相互作用
Fig. 2 Firefly luciferase complementary imaging system (L C I,A)a n d bimolecular fluorescence complementary technology(B i F C,B)assay of the interaction between bip130 a n d O S A7in vivo
第3期张雅芬，等：水稻biP 130与0SA 7蛋白互作的验证及biP 130对质膜H +-ATP ase活性的影响461与0S A 7的相互作用（图2-B )，在激光共聚焦显微镜下可以清楚看到b i p 130-c Y F P +0S A 7-n Y F P 共转的水
稻原生质体和0s P P 45-n Y F P + 0s D M I 3-c Y F P 阳性对照发出黄荧光，而阴性对照0S A 7-n Y F P + c
Y F P 和 b i p 130-c Y F P +n Y F P 都无发光现象，说明0S A 7与b i p 130在原生质体内也相互作用。
2.2 bipl 30与OSA 7互作区域的验证在欧洲生物信息学研究所网站（E B I )分析0
S A 7的蛋白质结构域，其中13〜130 a a 、227〜321 a a 、635〜 845 a a 为跨膜结构域;130〜227 a a 为
A 域超家族;323〜633 a a 为卤酸脱氢酶（H A D )超家族;341〜486 aa 为胞质N 结构域（图3-A )。按照其结构域的成分，将0S A 7截段为1〜321 a a 的跨膜结构域、341〜486 aa 的胞质N 结构域、486〜633 a a 的H
A D 超家族域、634〜951 a a 的跨膜结构域。A 跨膜结构域Transmembrane domain (13〜130 aa)
跨膜结构域胞质N 结构域 Transmembrane Cytoplasmic domain N-domain (227-321 aa) (341-486 aa)真菌之怒
跨膜结构域 Transmembrane domain (635〜845 aa)1 100 200 300 400 500 600
700 800 900 951A 域超家庭 卤酸脱氢酶超家庭
A domain superfamily Dehydrogenase (HAD) superfamily (130-227 aa) (323〜633 aa)
B SD-Trp/-Leu
阳性对照 Positive control
阴性对照 Negative control
OSA71〜321_A D /bip 130-BD
一汽佳宝6371OSA748"33-AD/bipl30-BD
OSA763權-AD/bipl30-BD
〇SA341 屬-AD/bipl30-BD OSA7^51-AD^pl30-BD
1 1/10 1/100• 0邊•癥骹•嫌访• 9 ^SD -Trp/-Leu/-H is/-Ade/X-a-gal
阳性对照 Positive control 阴性对照 Negative control 〇S A 7l ~321_A D /b i p l 3〇B D OSA748“33-AD/bipl30-BD OSA763權-AD/bipl30-BD OSA 綱6-AD/bipl30-BD
OSA7 剛-AD/bipl30-BD OsDMI3-cLUC +OsPP45-nLUC
OSA7341一86 -cLUC +nLUC
OsDMI3-cLUC +OsPP45-nLUC OSA71321-cLUC +nLUC OSA73 制6bipl30-nLUC OSA71-321bipl30-nLUC -cLUC +-cLUC ++bipl30-nLUC cLUC +bipl30-nLUC cLUC OsDMI3-cLUC +OsPP45-nLUC 〇S A 74 謂-cLUC +nLUC OsDMI3-cLUC +OsPP45-nLUC OSA76關 -cLUC +nLUC 〇S A 7486~633bipl30-nLUC OSA763權bipl30-nLUC -cLUC +-cLUC ++bipl30-nLUC cLUC +bipl30-nLUC
cLUC 图3 b i p l 30与O S A 7互作区域的验证
Fig. 3 Identification of the interaction region between bipl30 a n d O S A 7
A. 0S A 7蛋白结构域分析。
B.酵母双杂交试验体内验证0SA7341~486和bip130的相互作用。
C. LCI 分析表明烟草叶片中0S A 7的胞质N 结构域与bip130相互作用。
A. The protein structural analysis o l 0SA7.
B. Identification the ineraction between bip130 and 0SA7341 486 by yeast two-hybrid in vivo.
C. LCI assay shows that the interaction between cytoplasm N-domain o l
0SA7 and bip130 in tobacco leaves.
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