多杀性巴氏杆菌 HN06基因组分泌蛋白的预测与分析

彭忠;梁婉;刘文静;徐卓菲;谭臣;吴斌;周锐;陈焕春

【摘要】预测分析多杀性巴氏杆菌 HN06株的分泌蛋白并筛选多株巴氏杆菌共有 Sec 途径分泌蛋白，为研究多杀性巴氏杆菌亚单位疫苗候选蛋白奠定基础。利用 Signal P、Tmhmm、Phobius、Target P、Lipop、GPI-SOM、Tat P、SecretomeP 对已完成全基因组测序的多杀性巴氏杆菌 HN06株进行分泌蛋白预测及功能分析，并结合已公布全基因组序列的多杀性巴氏杆菌 Pm70、3480、36950的基因组序列筛选4株多杀性巴氏杆菌中共有的 Sec 途径分泌蛋白。结果表明，预测出 HN06株分泌蛋白共373个，其中 Sec 分泌蛋白157个，Tat 途径分泌蛋白8个，无信号肽的非经典途径分泌蛋白208个。Sec 分泌蛋白中被Ⅰ型信号肽酶识别的有120个，被Ⅱ型信号肽酶识别的有37个。再对 Pm70、3480、36950株进行 Sec 途径分泌蛋白的预测，使用 blastp 筛选它们共有的 Sec 蛋白114个。经过统计发现，多杀性巴氏杆菌 HN06株不同类型分泌蛋白的功能分布各有侧重，其中 ABC 转运蛋白和铁摄取相关蛋白对于巴氏杆菌毒力因子的研究具有很重要的意义。因此，对分泌蛋白的深入分析对于更清晰地了解巴氏杆菌的致病机制及筛选免疫原性蛋白具有重要意义。%To predict and analyze the sec

retory proteins of Pasteurella multocida HN06 and choose the common Sec proteins among different Pasteurella multocida strains,softwares including Signal P,Tm-hmm,Phobius,Target P,Lipop,GPI-SOM,Tat P and SecretomeP were combined to predict the secreto-ry protein of Pasteurella multocida HN06 which was completely sequenced by our laboratory.The shared Sec proteins among Pasteurella multocida Pm70,3480,36950 and HN06 were also identified.A total of 373 secreted proteins were identified,including 157 Sec-type signal peptides,8 Tat-type signal peptides and 208 no-classical proteins.Of the total 157 Sec proteins,120 proteins can be recognized by signal pepti-dase I and 37 proteins by signal peptidase II.Sec proteins of Pm70,3480 and 36950 were also predicted, and approximately 114 Sec proteins were shared by them.The predicted data demonstrated that the secre-tory proteins associated with various functions,and those related to the metabolism,iron uptake may have a significance to study virulence factors of Pasteurella multocida .Our study may shed a light on researc-hing the pathogenic mechanism of the pathogen and even the subunit vaccine candidate proteins against Pasteurella multocida .

李芸昕

【期刊名称】《动物医学进展》

【年(卷),期】2015(000)012

【总页数】5页(P6-10)

【关键词】多杀性巴氏杆菌;分泌蛋白;预测与分析

【作者】彭忠;梁婉;刘文静;徐卓菲;谭臣;吴斌;周锐;陈焕春

【作者单位】北戴河281医院华中农业大学动物医学院农业微生物学国家重点实验室，生猪健康养殖协同创新中心，湖北武汉 430070;华中农业大学动物医学院农业微生物学国家重点实验室，生猪健康养殖协同创新中心，湖北武汉 430070; 华中农业大学动物科学技术学院农业动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室，生猪健康养殖协同创新中心，湖北武汉 430070;华中农业大学动物医学院农业微生物学国家重点实验室，生猪健康养殖协同创新中心，湖北武汉 430070;华中农业大学动物医学院农业微生物学国家重点实验室，生猪健康养殖协同创新中心，湖北武汉 430070;华中农业大学动物医学院农业微生物学国家重点实验室，生猪健康养殖协同创新中心，湖北武汉 430070;华中农业大学动物医学院农业微生物学国家重点

实验室，生猪健康养殖协同创新中心，湖北武汉 430070;华中农业大学动物医学院农业微生物学国家重点实验室，生猪健康养殖协同创新中心，湖北武汉 430070;华中农业大学动物医学院农业微生物学国家重点实验室，生猪健康养殖协同创新中心，湖北武汉 430070

【正文语种】中文gm码

【中图分类】S852.615

多杀性巴氏杆菌是一种严重危害畜牧业的重要的革兰阴性病原菌，对多种畜禽及野生动物甚至人都能造成不同程度的感染和致病［1－2］。依据荚膜抗原的不同，多杀性巴氏杆菌常被分为A、B、D、E、F 5种血清型［3］。临床调查发现，不同血清型的多杀性巴氏杆菌表现出一定的宿主及致病偏好性［2］。多杀性巴氏杆菌的毒力因子众多，目前已知的毒力因子主要包括荚膜、脂多糖（LPS）、黏附因子、巴氏杆菌毒素（PMT）、铁摄取相关蛋白、唾液酸代谢、透明质酸酶以及外膜蛋白（OMP）［4］。

三集五大

有研究发现［5－6］，革兰阴性菌中1／3的蛋白合成后需要被转运或分泌到细胞外发挥作用，包括某些水解酶类、细胞毒素、胶质类、生长因子、激素类或抗体等，这类蛋白被称

为分泌蛋白。分泌蛋白一般占细菌基因组编码蛋白总量的10%～20%，它们不仅参与细胞信号转导，而且对于细胞增值、分化及凋亡都具有十分重要的调控作用。因此，研究细菌的分泌蛋白对于了解细菌的生命周期及其致病机理以及病原菌与宿主间的相互作用具有十分重要的意义。然而，由于分泌蛋白不易被高浓度提取，这对于开展分泌蛋白研究产生了较大的阻碍。

宋坚随着全基因组测序技术及生物信息学的发展，特别是细菌全基因组序列的测定和公布及配套生物信息学工具的开发为细菌分泌蛋白的预测和功能研究提供了巨大的帮助。自2001年分离于美国的禽源多杀性巴氏杆菌Pm70株的全基因组测序被报道后［7］，最近几年又有几株完整的多杀性巴氏杆菌全基因组序列被公布，其中的多杀性巴氏杆菌HN06株是一株来源于中国海南地区的D 型产毒素巴氏杆菌，分离自一头患有萎缩性鼻炎病猪的鼻腔，其全基因组序列的测序于2012年完成并公布［8］，是世界上第1株完成全基因组序列测定的产毒素多杀性巴氏杆菌。本研究将利用Signal P、Tmhmm、Phobius、Target P、Lipop、GPI－SOM、Tat P、SecretomeP 等生物信息学工具预测出其分泌蛋白［9］，并将这些蛋白与其他3株多杀性巴氏杆菌（Pm70、3480、36950）的分泌蛋白进行比较分析，筛选出4株菌株共有的经典途径Sec分泌蛋白，并对其进行了初步的功能分析，为进一步筛选多杀

性巴氏杆菌亚单位疫苗候选蛋白奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

多杀性巴氏杆菌Pm70、3480、36950 及HN06的全基因组信息均下载于GenBank（http：／／bi.v／genome／genomes／912）；分泌蛋白预测及分析工具包括Signal P4.1（http：／／www.cbs.dtu.dk／services／SignalP／）；Tmhmm v 2.0（http：／／www.cbs.dtu.dk／services／Tmhmm／）；Phobius（http：／／phobius.sbc.su.se／）；Target P1.1（http：／／www.cbs.dtu.dk／services／TargetP／）；Lipo P1.0（http：／／www.cbs.dtu.dk／services／LipoP／）；GPI－SOM（http：／／gpi.unibe.ch／）以及SecretomeP 2.0（http：／／www.cbs.dtu.dk／services／SecretomeP／）。

1.2 方法

1.2.1 Sec途径分泌蛋白的筛选分泌蛋白的氨基酸序列的N 端通常有一段10个～50个氨基

初中作文教学论文酸的疏水性片段即信号肽［6］，用以引导随后的蛋白质多肽链穿过内质网膜到达腔内，完成后，一些信号肽序列被信号肽酶切除，释放出成熟的分泌蛋白。因此蛋白质序列N 端是否具有信号肽可以作为一个重要的预测依据。对Pm70、3480、36950及HN06等4个基因组的蛋白序列用Signal P4.1［10］，进行信号肽的预测，保留具有信号肽的蛋白。使用Tmhmm v2.0［11］筛选出具有0或1个跨膜螺旋的蛋白，由于该软件在判断具有1个跨膜螺旋的蛋白时，不能准确区分信号肽和跨膜区，因此需要使用Phobius软件重新预测具有1个跨膜螺旋的蛋白，剔除确实具有跨膜区的蛋白［12］。再利用GPI－SOM 判断上述筛选的蛋白中是否具有锚定位点，剔除锚定蛋白。最后，采用Target P1.1软件预测蛋白的亚细胞定位，进一步确定该蛋白的分布类型，保留分泌型蛋白。上述筛选的蛋白在LipoP 软件的预测下被分为4类，即被Ⅰ型信号肽酶识别的蛋白、被Ⅱ型信号肽酶识别的蛋白、细胞质蛋白和跨膜蛋白。

综上所述，具有信号肽、不含跨膜螺旋、无GPI锚定位点、通过分泌途径分泌且能被Ⅰ型和Ⅱ型信号肽酶识别的蛋白可初步预测为Sec分泌蛋白［13］。

1.2.2 Tat途径分泌蛋白的筛选使用Tat P 软件筛选出具有RR 信号肽且D 值大于默认阀值0.36的蛋白，然后使用Tmhmmv 2.0和Phobius筛选出其中无跨膜螺旋结构的蛋白。

1.2.3 无信号肽的非经典分泌蛋白的筛选用Signal P4.1筛选出没有信号肽的蛋白，并用SecretomeP 2.0 软件选取secp 值大于0.5 的序列。经Tmhmmv 2.0和Phobius筛选，保留无信号肽、secp值大于0.5的无跨膜螺旋蛋白［14］。

2 结果

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