高亚朋;苏茉;梁建荣;黄洁;唐云明
【摘 要】Acid Phosphatase (ACP) was extracted crudely from Mung Bean sprout. ACP was a single electrophoretic band in SDS - PAGE by ammonium sulfate fraction precipitation, DEAE - sepharose chromatography and Superdex S - 200 gelfiltration. Its purification fold was 156.3, and the specific activity was 347.0 U/mg. Superdex S -200 chromatography showed that the molecular weight of this ACP was 34.6 kD, and SDS - PAGE showed that the molecular weight of ACP subunit was 33.1 kD. It also showed that ACP from Mung Bean was a single subunit protease.The optimum pH of ACP was 5.2 and the optimum temperature was 40℃. Its Michaelis - Menten Kinetics ( Km ) was 4.28 mmol/L when pNPP was used as a substrate. Mg2+ ,Co2+ activated the enzyme while Hg2+ ,Cu2+ ,Pb2+ and Zn2+inhabited its activity obviously, and the order is: hg2+ ＞ cu2+ ＞ pb2+ ＞ zn2+. The enzyme was not sensitive to K + and Ca2+.%从绿豆芽中提取酸性磷酸酶粗酶液.经分段盐析,DEAE-琼脂糖柱离子交换层析及Superdex-200凝胶过滤后,得到经SDS-聚丙烯酰
胺凝胶电泳为单一蛋白区带的酸性磷酸酶.提纯倍数为156.3,酶液比活力为347.0 U/mg.凝胶过滤法测定酶分子质量为34.6 ku,SDS-PAGE测定酶的亚基分子质量为33.1ku.证明绿豆酸性磷酸酶为单亚基酶.该酶最适pH为5.2 ku,最适温度为40℃.以pNPP作底物时Km为4.28×10-3mol/L.Mg2、C02+对酶有激活作用,而Hg2+,Cu2+,Pb2+和Zn2+对该酶有明显的抑制作用,依次为:Hg2+＞Cu2+＞Pb2+＞Zn2+.K+,Ca2+对酶影响不明显. 网购蛇被咬进ICU
【期刊名称】《中国粮油学报》
【年(卷),期】2011(026)005
【总页数】5页(P92-96)
【关键词】绿豆;酸性磷酸酶;分离纯化;性质
【作 者】高亚朋;苏茉;梁建荣;黄洁;唐云明
波士顿矩阵【作者单位】西南大学生命科学学院重庆市甘薯工程研究中心三峡库区生态环境教育部重点实验室,重庆400715;西南大学生命科学学院重庆市甘薯工程研究中心三峡库区生态环境
教育部重点实验室,重庆400715;西南大学生命科学学院重庆市甘薯工程研究中心三峡库区生态环境教育部重点实验室,重庆400715;西南大学生命科学学院重庆市甘薯工程研究中心三峡库区生态环境教育部重点实验室,重庆400715;西南大学生命科学学院重庆市甘薯工程研究中心三峡库区生态环境教育部重点实验室,重庆400715
【正文语种】中 文
【中图分类】Q556
酸性磷酸酶(Acid phospoatase，简称 ACP，E．c．3．1．3．2)，是一组在酸性条件下可将底物中的磷酸单酯键水解释放出无机磷的巯基酶，在生物磷代谢中起着重要作用［1］。ACP不仅与生物的生长调节、代谢调节及信号转导等方面的生理机能关系密切，亦能增强植物对缺磷、干旱、低温等逆境的抗性，因此近年被广泛重视［2－4］。但由于ACP通常具有非绝对专一性［5］和存在多种同工酶［2］，其具体的生理生化功能尚有待研究。综于以上原因，研究开发来源丰富的植物ACP具有重要意义。本试验以成本低且耐旱、耐瘠、也耐酸、耐碱的绿豆种子为研究材料，分离纯化了ACP，并对其部分酶学性质进行了研究，以期为进一步研究ACP提供理论参考及对作物遗传改良提供有益帮助。
1．1 材料与试剂
冀绿豆2号种子:市售;对硝基苯磷酸二钠(pNPP):MERCK公司。
1．2 试验方法
1．2．1 ACP粗酶液的制备及分离纯化
1．2．1．1 ACP 粗酶液的制备
冀绿豆2号种子50 g，30%H2O2消毒5 min，双蒸水多次冲洗后浸泡8 h左右，于28℃培养箱中催芽48 h。将萌发的绿豆种子按1∶4加入预冷的50 mmol/L HAc－NaAc缓冲液(pH 5．0，含2 mmol/L MgCl2，10 mmol/L ME，2 mmol/L EDTA)，匀浆过滤，抽提2 h，滤液离心(12 000 r/min，10 min，4 ℃)后的上清液即为粗酶液。
1．2．1．2 硫酸铵分部盐析
粗酶液置于恒温磁力搅拌器上，缓慢加入干燥硫酸铵粉末至20%饱和度。4℃静置2 h，离心(12 000 r/min，15 min，4 ℃)，弃沉淀;依据上述方法，将离心上清液加入干燥硫酸铵粉
末至70%饱和度，4℃静置2 h，离心(8 000 r/min，20 min，4 ℃)，弃上清;沉淀用 50 mmol/L HAc－NaAc缓冲液 (pH 5．0，含2 mmol/L ME)悬浮，检测ACP的蛋白质含量和酶活力，之后装入透析袋中，在0．005 mol/L pH 5．0 HAc －NaAc缓冲液(含2 mol/L ME)中透析，除去SO2－4。
1．2．1．3 离子交换与凝胶柱层析
将透析后的粗酶液过 DEAE－琼脂糖柱，用50 mmol/L HAc－NaAc(pH 5．0，含1 mol/L NaCl)缓冲液进行梯度洗脱(NaCl浓度范围0～1 mol/L)，流速0．5 mL/min，收集ACP活性管，双蒸水透析脱盐，真空冷冻干燥浓缩后上Superdex－200凝胶柱，收集ACP活性管，透析脱盐后冷冻干燥得到ACP纯品。
1．2．2 酶活力的测定及部分理化性质鉴定
1．2．2．1 酶活力测定
依据文献［6］并改进为:3 mL 50 mmol/L HAc－NaAc pH 5．0缓冲液(含5 mmol/L β –巯基乙醇)、1mL 10 mmol/L MgSO4及 1 mL 5 mmol/L pNPP，于37℃水浴5 min;加0．2 mL酶
液，反应10 min，之后加2．5 mL 终止剂(0．2 mol/L NaOH)，终止反应。以双蒸水替代酶液作对照，在420 nm下测光吸收值。根据对硝基苯酚(PNP)标准曲线［7］计算产物生成量。酶活力单位定义为:在37℃条件下，以pNPP为底物，每升溶液每分钟底物水解后产物的微摩尔数［6］。采用紫外分光光度法和考马斯亮蓝法测定蛋白含量［8］。采用SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳和凝胶过滤法鉴定酶的纯度及确定酶亚基相对分子质量［9］。
1．2．2．2 最适温度、pH、温度和酸碱稳定性测定
加权总分依据上述反应体系，以5 mmol/L的pNPP为底物，在pH 2～8的 HAc－NaAc及 Tris－HCl缓冲体系中设定一系列pH梯度，测定各梯度pH的酶活力，确定该酶最适pH;将酶液在各pH梯度放置一定的时间，确定酶对pH的稳定性。在20～80℃范围内，设定一系列温度梯度，测定不同温度梯度下ACP的酶活，确定最适温度。将酶液在该温度梯度下孵育一定的时间确定酶对温度的稳定性。
1．2．2．3 Km 值的测定
依据酶活测定体系，配制不同的 pNPP浓度(2．0、2．5、3．0、3．5、5 mmol/L)，分别
测定各浓度的底物与酶作用2、4、6、8、10 min 时的吸光度值，计算酶活力。将各底物浓度的酶活力对反应时间作图，求出酶促反应速度V;按结果分别求出1/V和1/［S］，并按照Lineweaver Burk法作图求出该酶的Km值。
1．2．2．4 金属离子对酶的影响测定
将 0．2 mL 酶液各加入到含有浓度为 1、2、3、4、5 mmol/L(其中 Hg2+与 Cu2+浓度为 0．1、0．2、0．4、0．6、0．8 mmol/L)金属离子的 4 mL pH 5．0 HAc －NaAc缓冲液中于37℃作用30 min，依据上述酶活反应体系，加入底物，反应10 min，测活。采用等量酶液与不加金属离子的该缓冲液混合做标准［10］。
2．1 酶的纯化
酶液经过DEAE－琼脂糖柱层析及Superdex－200凝胶过滤，洗脱曲线如图1，图2所示，酶的整个纯化结果如表1所示。从图1可以发现有两个活力峰，由于酸性磷酸酶通常存在多种同工酶，从而推测该酶可能存在两种同工酶形式。从图2可知各种蛋白得到了较好的分离效果，且活性峰和蛋白峰处在同一管数，这为下一步得到一个好的电泳结果奠定了基础。
2．2 酶的纯度鉴定
经Superdex－200柱纯化的酶液进行SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，考马斯亮蓝R－250染，脱后显现单一条带，说明该酶已经达到电泳纯(图3)。
2．3 酶的相对分子质量
经Superdex－200凝胶过滤测得酶分子质量约为34．6 u，经SDS－PAGE测得酶的亚基分子质量为33．1 u，可见冀绿豆2号ACP为单亚基酶。
2．4 最适pH、最适温度
最适pH测定结果如图4所示，冀绿豆2号ACP的最适pH为5．2，这符合ACP的最适pH一般小于6的特点。
最适温度测定的结果如图5所示，冀绿豆2号ACP最适反应温度是40℃。
2．5 酶的热稳定性
酶对温度的敏感性试验结果如图6所示。冀绿豆2号ACP在20～60℃温度范围内稳定性较好。60℃保温4 h后剩余活力还高达一半以上。但在高于环境温度60℃时，酶蛋白失活迅速。
2．6 酶的酸碱稳定性
酶对酸碱度稳定性试验结果如图7所示:在pH 3～6范围内酶活性变化不大，较为稳定。但在pH为2的强酸条件下，酶分子结构会遭到破坏从而迅速失活，2 h后酶活只保留18%。pH＞7时，酶稳定性较差，10 h后活性保留30%，表明该酶对酸耐受性较好，对碱比较敏感。
2．7 Km值的测定
琼斯模型
米氏常数Km测定结果如图8所示:通过直线与X轴的交点求出Km=4．28×10－3mol/L。该酶Km值与动物性材料的 ACP［6，12］相比较大，说明该酶对pNPP的亲和性低于动物性材料ACP。
2．8 金属离子对酶活性的影响
英国清教
由图9a可知Cu2+，Hg2+对酶活性有强烈抑制作用;由图9(b)可知 Pb2+、Zn2+对酶也有较强抑制作用，Mg2+对酶有的激活作用，Co2+低浓度时对酶有激活作用，随着浓度的增大，酶活又开始降低。而K+、Ca2+对酶活性基本无影响。
芳纶头盔与从其他材料中分离纯化ACP的试验相比较，本试验有分离纯化倍数高、比活高和回收率偏低3个特点。回收率偏低主要是因为该酶同工酶较多［2］，在经硫酸铵盐析和DEAE－琼脂糖柱后去除了部分同工酶，纯化出单一酶的过程必然会损失其他同工酶。另外，该酶在接近中性的双蒸水中透析存在部分失活现象，这也是导致回收率偏低的另一原因。
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