β-葡聚糖酶

植物β－1，3－葡聚糖酶的研究进展

β-1,3-葡聚糖酶参与了植物的多种生长发育过程，包括细胞分裂、小孢子发生、花粉萌发、育性、韧皮部胼胝质去除、受精、种子萌芽及植物生长调控等过程。20世纪70年代以前，对β-1,3-葡聚糖酶的研究主要集中于它对植物本身不同发育阶段的作用，随着分子生物学技术在植物抗病基因工程中的逐步应用，β-1,3-葡聚糖酶基因的抗病研究取得了快速发展。目前，β-1,3-葡聚糖酶基因在植物抗病基因工程研究中已被认为是最具吸引力的基因之一。

1 β-1,3-葡聚糖酶基本生物学特性和分类

已知的β-1,3-葡聚糖酶均属于糖基水解酶第十七家族，其成员具有共同的氨基酸序列结构：(LIVM)一x一(LIVM-FVW)3一(STAG)-E-(ST)-G- W-P-(Srr)-X-G．(Lan等，1998)，β-1,3-葡聚糖酶分为外切酶和内切酶，目前主要研究的是内切酶。它的分子量为32-37kD，等电点从酸性到碱性。它的作用底物为以β-1,3-苷键连接起来的多聚糖，以随机作用方式将多聚糖分解成为糊精或寡聚糖。各种类型的β-1,3-葡聚糖酶已从多种植物中分离出来。根据其等电点、定位、mRNA表达模式及序列的同源性等特点可将其分为四种不同类型。I类葡聚糖酶为碱性，主要存在于液泡中，体外具较强抑菌活性。碱性β-1,3-葡聚糖酶通常具有1个液泡定位的羧基末端多肽(carboxyl terminal polypetide，CTPP)结构，CTPP中往往含有糖基化位点即CTPP切除信号氨基酸结构， CTPP的缺乏使得β-l,3-葡聚糖酶分泌到胞外，因此，CTPP存在与否成为β-1,3-葡聚糖酶分类的重要依据。现已分离出三种编码I类葡聚糖酶的cDNA，它的前体蛋白含有N一端信号肽及C一端液泡导向肽序列。在根及老叶中组成型表达．占可溶性蛋白的5％-10％，且主要分布在叶的表皮细胞层中。受病源菌、乙烯、水杨酸、伤口、UV等因素诱导，但被auxin／cytokine所抑制，并受发育的调节。Ⅱ类葡聚糖酶具有较低等电点，被称为酸性葡聚糖酶。主要分布在细胞间隙，在体外无抑菌活性，它的氨基酸序列中不具有C一端延伸序列。与I类酶有55％同源性，但Ⅱ类酶与I类酶在血清学上具有相似性。它主要包括PR2(又称PR-36)。PR-N，PR-O(又称PR-37)，能被病原菌诱导，I类葡聚糖酶与Ⅱ类葡聚糖酶相比．只有54％~59％的同源性。Ⅲ类酶属于分布在胞外的诱导物释放型β-1,3-葡聚糖酶(PR-Q’)，分子量为35KD(又称PR-35)。PR-Q’由烟草花叶病毒(TMV)诱导表达，其诱导速度慢于或相同于Ⅱ类葡聚糖酶，持续时间也较短嘲。Ⅳ类葡聚糖酶为酸性胞外非诱导型β-1,3-葡聚糖酶(PR-O’)，分子量为25KD,是一种二聚体，不能被病原物诱导㈣。与Ⅱ类、Ⅲ类酶相似性较小，且与前三种酶均不能发生抗血清交叉反应。

2 β顺义西辛小学-1,3-葡聚糖酶抗病机制研究

植物受病原物侵染时常产生一些PR蛋白进行抵御，β-1,3-葡聚糖酶即是其中之一。PR类蛋白是由植物寄主基因编码的、在病理或相关条件下诱导产生的蛋白质,PR类蛋白与植物系统获得性抗性fSystemic acquired resistence,SARl和系统诱导性抗性fInduced Systemic Resistance ISRl的建立密切相关。根据蛋白质之间氨基酸序列的相似程度，目前已经发现的PR蛋白可分为十一类，β-1,3-葡聚糖酶属于PR2类，在植物的抗病过程中扮演着重要角。β-1,3-葡聚糖是真菌细胞壁的重要结构成分。许多真菌的菌丝尖端β-1,3-安瓦尔事件葡聚糖暴露在表面，能够直接受到β-1,3-葡聚糖酶的攻击。体外抑菌实验表明，β-1,3-葡聚糖酶对菌丝生长具有抑制作用。不过，只有液泡定位的碱性葡聚糖酶能够降解菌丝壁，从而抑制生长，而胞间定位的类型则没有抑菌活性。当然，真菌也合成一些葡聚糖酶抑制蛋白fGlucanase Inhibitor Protein RIPl，RIP特异性地抑制寄主内源葡聚糖酶的活性旧，这反映了植物与微生物共进化的一种关系。更为重要的是，在水解过程中由真菌细胞壁释放出来的寡糖能够作为植物多种抗病反应的激发因子。激发子作为病原菌——植物相互识别的重要信号分子，是指能诱导植物产生任何防卫反应的因子fHahn 1996)。杜良成和王钧(1992)的研究已证实病菌来源的激发子可诱导植物B-1,3-葡聚糖酶不同程度的表达。SA作为一种非生物激发子，可诱导植物PR基因表达。被用于PR基因启动子的调控机制研究ffShah和 Klessig，1996)。激发子和SA诱导植物的全面抗病反应，可作为诱导物诱导与抗病反应有关的酶类如苯丙氨酸解氨酶(PAL)、4一香豆酸-CoA联结酶)等的积累，由此对植保素、木质素等抗病物质的合成与积累，增强植物的抗病性起促进作用。这方面的报道集中在大豆与大豆疫病菌的互作研究中。在大豆中，已经发现葡聚糖激发子结合蛋白GEBP fGlucan Elicitor Binding Protein GEBP)，定位于大豆根部细胞的质膜上，能够特异性地结合β-1,3-葡聚糖酶降解过程中释放出来的寡糖激发子，诱导植物的防卫反应。

3 β－l,3-葡聚糖酶在植物中的发育调节及其可诱导性

β-1,3-葡聚糖酶是重要的水解酶，它们不仅在植物抗病中起作用，还在植物发育中起作用，包括谷类发芽、胚轴和胚芽鞘发育、韧皮部运输和胼胝质的运动、微管组织运输调节和细胞壁生物合成、花的发育、小孢子形成、花粉管发育、果实成熟、植物衰老以及固定和愈创性葡聚糖的清除以及调控胚乳发育、育性调控及种子后成熟．也用于研究转化体基因沉默现象等方面。这些不同的发育过程均与β-1,3一葡聚糖酶有密切关系， Leubner Metzger等利用反义基因技术揭示了3-1,3-葡聚糖酶在打破烟草种子休眠中所起的重要作用。Stieglitz(1977)在研究Lilium的小孢子发育过程中发现，β-1,3-葡聚糖酶在小孢子从四分体状态释放出来之前有一个增长的峰值。随后小孢子的胼胝质壁被溶解，释放出成熟的花粉类。已证实此过程中内切葡聚糖酶起关键作用。但此酶在小孢子成熟之前如何被准确诱导的机理还不清楚。将修饰过的β-1,3-葡聚糖酶导人烟草中使其在绒毡层中提前表达，使转基因植株育性降低。而在牵牛及高粱体中一些雄性不育突变体中发现是因为葡聚糖酶在小孢子发育过程中提前释放．从而造成小孢子发育异常。Van de Rhee(1993)对碱性葡聚糖酶5’调控序列的研究表明：在1476b0的启动子序列中，1476至44bp之间的片段对发育调控的表达是必需的。

在正常植物体中葡聚糖酶在整株植物中的分布是不均衡的，根部和基部老叶中含有很高的酶活性，而顶部幼叶中几乎检测不到，究其原因，可能是由于发育调节或激素对它的控制作用。Felix(1985)研究认为，组织培养中，烟草中一种特异的内切β-1,3-葡聚糖酶受到生长素和分裂素的调节。当两种激素同时加人培养基时，90％的酶活性被抑制，而当从前者培养基移人加有一种激素或不加激素的培养基时，此酶的表达量到第七天时比前者增加了约10倍。Eichholz(1983)认为是激动素(kinetin)阻碍了B-1,3-葡聚糖酶的重新合成p回。 Felix(1986)则认为阻碍β-1,3-葡聚糖酶的合成并不是激动素独立作用的结果，而是由于分裂素和生长素两者生理浓度共同决定。

β职业选择理论-1,3-葡聚糖酶基因的表达不仅与病原菌侵染有关，还与其他生物或非生物诱导物有关。非生物诱导包括物理因素和化学因素。1987年Dean R．A．发现，机械或干冰损伤、电磁处理可不同程度地诱导烟草对霜霉病(Peronosporatabacina)的抗性；紫外线处理各种豆类的下胚轴可使植株叶片获得对病fColletotrichumlinderthianum)的抗性。后来陆续报道X一射线、局部热处理等也具有诱导抗病性的功能。已有100多种化学物质被用作诱导因子，较早使用的是乙酰水杨酸钠、多聚腺苷酸等，可以诱发烟草对TMV的抗性，由此形成了20世纪70-80年代对诱导抗性研究的第一个热潮。董汉松等在烟草抗赤星病的研究中建立了诱导因子谱，同时也发现有诱导感病性的化学物质，如马来酰肼等，表明感病性也和抗病性一样，可以由不同的物质诱导产生。生物诱导包括：(1)真菌。这类因子包括病原和非病原菌、致病力不同的菌株及其不同结构和分子组分，前人已有不少综述。在烟草抗赤星病诱导中，已从全国各烟区分离的209个赤星菌株中选出致病力弱的菌株用作诱导因子，并已成功地用于大田试验，取得良好效果。(2)细菌。可用作诱导因子的细菌包括死体和活体，病原细菌和非病原细菌及细菌的不同成分，如菌体脂多糖(LPS)、胞外多糖联想et600(EPS)等。目前，已有不少报道证明，细菌的无毒基因favrl或过敏／致病基因(hrp)产物，起抗病防卫激发子的作用。(3)病毒。1929年首次报道病毒的交叉保护现象。今后，有两方面的工作值得注意，一是已证明病毒诱导的抗病性对不同作用、不同类型病原物都有效。例如，烟草普通花叶病毒仃MV)可诱导对TMV和霜霉病等12种病害的抗性：二是病毒辅助因子的作用，如含卫星RNA的CMV诱导烟草对赤星病的抗性。董汉松研究表明，RNA的存在使效果明显增强，但田波实验室报道认为，抗病诱导作用主要。

4 β-1,3-葡聚糖酶基因信息研究

β-1,3-葡聚糖酶cDNA编码长度为359个氨基酸的多肽．前体酶在郑州大学N端含有21个亲水碱基．是蛋白转移的信号肽序列，C端含有22个残基．推测其中含有N糖基化位点．这在成熟蛋白中是没有的，在最初的多肽合成后，前体酶进行加工，将前体酶中的信号肽序列和糖基化位点切除，随后才产生成熟的酶。

从20世纪60年代起，许多植物中的B—l'3一葡聚糖酶基因信息已被逐渐研究清楚，如大麦、水稻、玉米、高粱、小麦、拟南芥、鹰嘴豆、大豆、早熟禾、三叶胶树、西红柿、亚麻、香蕉、烟草、菜豆、豌豆、桃树、马铃薯、葡萄等。Mohnen和Shinshi(1985)最早获得碱性葡聚糖酶基因序列，它们利用激素诱导的烟草总RNA构建了eDNA文库。利用分离的mRNA体外翻译后杂交筛选的方法获得了含有约lkb插入片段的β-l，3一葡聚糖酶基因片段的克隆，并由此获得了对应的mRNA和完整基因序列，其基因全长为1083bp，开放阅读框编码359个氨基酸组成的多肽，分子量为39KD。而成熟蛋白的分子量比前体蛋白小4KD。其中N端信号肽约为2KD．因此前体蛋白还经历了其他的加工过程，即C端多肽序列(2KD)在进入液泡时被切除，成为成熟的葡聚糖酶[31,32]。Linthorst(1991)对烟草编码B-1,3-葡聚糖酶的基因结构进行分析认为，在烟草基因组中，至少有7个基因编码酸性B-1,3-葡聚糖酶，而碱性酶也是拥有至少4个基因的家族编码。对其中较典型的一种酸性和碱性葡聚糖酶基因组克隆进行分析表明。酸性酶基因编码序列中包含1个341bp的内含子．位于推测的信号肽序列之后，碱性酶基因克隆与前者相仿．对两个克隆的核苷酸序列比较表明有57％的一致性，但其上游调控区、内含子序列和下游序列则无明显相似性。二者在氨基酸序列上有49％的同源性，酸性酶编码结束位置正好位于碱性酶C端多肽起始位置，成熟碱性酶分子量为37 KD，p14．89。

Chve(1995)对橡胶(Hevea brasiliensis)乳汁管中高效表达的B-1,3-葡聚糖酶基因进行了较为详尽的分析。利用烟草(N．plumbaginifoli)B-1,3-葡聚糖酶cDNA(gnl)做探针，从橡胶cDNA文库中分离到一个含有约1．2kb插入片段的编码B-1,3-葡聚糖酶的克隆。此cDNA由一个40b05’非翻译区，一个1125b0编码区及一个76bp的3’端非翻译区和多聚腺苷酸尾所组成。编码区为一个374个核苷酸的碱性蛋白，分子量为41kD,它的核苷酸序列与gnl相比有68％一致性，氨基酸序列有66％一致性。氨基酸序列分析表明，前体蛋白含有C端和N端延伸，N端富含丝氨酸并紧接着一个疏水区域，属于典型信号肽序列。C端序列与gnl相比有一定的保守性，特别是靠近C端多肽末端的几个疏水氨基酸构成的疏水／酸性结构构成了一种定向信号。用叶柄切片进行的原位杂交表明，橡胶中β-1,3-葡聚糖酶,mRNA定位于乳汁管细胞中。基因组Southern分析则暗示，在H．brasiliensis中， B-1,3-葡聚糖酶由一个低拷贝基因家族编码。 Northern印迹分析表明， β-1,3一葡聚糖酶的 mRNA在乳汁道中的含量比叶中的高。到目前为止，已从烟草、菜豆、马铃薯等多种植物中分离到各种类型的β-1,3-葡聚糖酶基因，鉴于它在植物发育及防卫反应中的重要作用，对其分子生物学方面的深入研究将为进一步揭示其作用机制及今后的利用打下理论基础。

5存在问题及展望

B-1,3-葡聚糖酶的抑菌活性引起人们的重视，但是迄今为止在转入该酶基因的小麦、烟草、猕猴桃和玫瑰等植物获得的转基因植株中，其抗性表现不尽一致。这表明不同的植物在抑菌的细节上可能存在差别，还有待进一步探讨。由于一些实验表明，几丁质酶和B-1,3-葡聚糖酶在体外的协同抑菌效果，因此．更多的转化研究则是将β-1,3-葡聚糖酶和几丁质酶共同导入受体植物基因组中。Jonggedik等将烟草的Class I型几丁质酶基因转化番茄时发现，二者有明显的协同效果，番茄发病率降低36％-58％．而单基因表达时抗病能力没有增强，但这也不能完全证明在所有植物中两者协同表达都可以提高植物的抗病性。如对于卵菌纲的真菌而言，由于其菌丝壁不含几丁质，转化几丁质酶基因可能就没有效果，而导入β-1，3一葡聚糖酶单一基因可能将更有意义。

PR类的β-1，3-葡聚糖酶或组成型、或诱导型表达．在不同组织中有不同的表达反应．而且酶也被运输到细胞的不同部位，对于抵御真菌病原的攻击具有积极意义。但到目前为止，还没有证据表明该酶在“病原一寄主”的相互作用中表现为“基因对基因”模式，因此，我们推测其参与的可能是一种对病原攻击广泛的、非特异性的反应。然而，Neuhaus等(1992)将烟草液泡定位的碱性β-1。3一葡聚糖酶Gla的反义基因导人烟草后．虽然 Gla的表达在RNA水平和蛋白质水平显著减少。但其感病性没有明显变化。所以作物可能存在多种补偿机制以适应β-1，3一葡聚糖酶表达水平的下降。恰恰相反的是，利用Gla的反义基因转化栽培烟草和野生烟草时。转基因植物表现出TMV抗性明显提高。由于β-l，3一葡聚糖酶表达量下降，可能导致TMV侵染部位葡聚糖酶降解要缓慢些，所以葡聚糖酶可能是病毒传播的一个物理障碍。

德阳市实验小学校园网葡聚糖酶在植物中广泛分布，而且以多种类型存在。它除了具有防卫功能外，还与植物发育紧密相关。目前，I类葡聚糖酶与几丁质酶在抗真菌病基因工程中的应用已有较多的尝试，也取得了一些预期效果．而将其应用在雄性不育基因工程中则刚开始。多种因素参与了植物对于病原攻击的防御反应，这些因素的协同表达往往能增强寄主的抗病能力。因而多因素的改造将成为植物抗病育种的一个发展方向。当然它也面临着种种问题，如构建载体、转化植物的难度、外源基因的沉默以及数量性状基因的利用等。

内蒙古农业科技2006(5)

何江峰1，韩冰2，赵宏鑫1(1．内蒙古农业大学生物工程学院，内蒙古呼和浩特010018；2．内蒙古大学生命科学学院，内蒙古呼和浩特010021)

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