测癌试纸马全英;安芳兰;刘萍;祝秀梅;吕志慧;王凡;刘学荣;黄银君;牟克斌
【摘 要】美国影院击案
文章就沙门氏菌相关基因的特点、减毒沙门氏菌载体激发的免疫应答、进入机体免疫系统的机制、减毒沙门氏菌的应用、载体疫苗的优越性及潜在危险性几方面综述了减毒沙门氏菌作为口服疫苗载体的研究进展,为新型菌苗的研制提供一种新的思路。%This article related genes from Salmonella characteristics of the related gene, attenuation salmonella carrier stimulate the immune re- sponse, into the mechanism of the immune system, the application of attenuated salmonella typhimurium, the superiority of vaccine vectors potentially dangerous areas and review of the attenuated salmonella as oral progress in a new type vaccine vectors for the development of novel vaccine provides a new way of thinking. 【期刊名称】《贵州畜牧兽医》
【年(卷),期】肛栓2012(036)005
唧唧复唧唧
【总页数】5页(P16-20)
【关键词】减毒沙门氏菌;活载体疫苗;基因减毒;免疫机制
【作 者】马全英;安芳兰;刘萍;祝秀梅;吕志慧;王凡;刘学荣;黄银君;牟克斌
【作者单位】甘肃省兰州中农威特生物科技股份有限公司,甘肃兰州730046;甘肃省兰州中农威特生物科技股份有限公司,甘肃兰州730046;甘肃省兰州中农威特生物科技股份有限公司,甘肃兰州730046;甘肃省兰州中农威特生物科技股份有限公司,甘肃兰州730046;甘肃省兰州中农威特生物科技股份有限公司,甘肃兰州730046;甘肃省兰州中农威特生物科技股份有限公司,甘肃兰州730046;甘肃省兰州中农威特生物科技股份有限公司,甘肃兰州730046;甘肃省兰州中农威特生物科技股份有限公司,甘肃兰州730046;甘肃省兰州中农威特生物科技股份有限公司,甘肃兰州730046
【正文语种】中 文
【中图分类】S816.15
随着分子生物学、遗传学和免疫学等学科的发展，疫苗的研究和开发日益重要。近年来，将DNA疫苗技术应用于兽医领域的尝试性研究也越来越多［1］。细菌作为疫苗载体为人们提供了具有广泛应用价值的疫苗设计思路，特别是近年来细菌性DNA疫苗载体的研究成果，使人们对细菌疫苗载体的研究兴趣越来越浓厚，以减毒沙门氏菌为载体的口服活菌苗研究是目前的研究热点之一。减毒沙门氏菌作为载体携带并表达外源基因，经免疫后不仅激发机体产生针对载体本身的免疫应答，而且还能产生针对外源抗原的免疫应答［2，3］。另外，减毒沙门氏菌疫苗还具有易于生产和运输，成本较低等优点，因此有利于大规模的免疫接种。
经济研究参考
1 减毒沙门氏菌的相关基因
早期的减毒手段主要是利用化学物质诱变和紫外线照射，但这两种手段存在一些不足:减毒具有很大的盲目性，且在疫苗的制备过程中质量很难得到保证。近年来，随着分子生物学技术的发展和对沙门氏菌致病机制的进一步了解，应用分子遗传学方法在沙门氏菌染体基因组上随机插入1个转座子或删除1段或几段基因片段的减毒方法已引起了人们广泛的关注。
1.1 控制芳香族化合物生物合成的aro基因 野生型菌体中存在一系列aro酶，它们控制着分支酸的合成。分支酸是对氨基苯甲酸(pABA)、2，3－二羟基苯甲酸(DHB)、苯丙氨酸(Phe)、酪氨酸(Tyr)和氨酸(Trp)等芳香族化合物合成途径的分支点。一旦aro基因发生缺失，则阻断芳香族化合物合成途径，菌体在得不到外源芳香族化合物的条件下不能增殖，其毒力亦随之丧失［4～8］。近年来，研究者们还引入了双基因突变的营养缺陷型减毒株，如aroA、aroC 株，aroA、aroD 株，aroC、aroD 株等，这类减毒株大大减少了毒力回复的可能性。
1.2 影响碳水化合物利用途径的galE基因 galE突变株缺失尿苷二磷酸半乳糖－4－差向异构酶(UDP－Gal－4－epimersae)，此酶缺失导致 Leloir氏半乳糖代谢途径发生阻断，从而半乳糖－1－磷酸盐(galactose－1－phosphate)、UDP和 Gal大量的聚集在细胞内，由此产生溶菌现象，细菌毒力亦随之丧失。半乳糖代谢发生的这一障碍，可由加入外源性半乳糖得到补偿，只产生部分溶菌并仍可生物合成完整的细胞壁脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)，而LPS是保持菌体免疫原性的一个决定因素。 1.3 pur系列基因与asd基因 pur系列基因是编码嘌呤生物合成途径中一系列酶的基因，如有美国标准普尔公司
缺失，嘌呤就不能合成，从而抑制细菌DNA的合成，使毒力减低［9］，常用的有 purA、purE。pur系列减毒力不如aro系列。asd基因编码天冬氨酸半醛脱氢酶，如缺失就不能合成革兰氏阴性细菌细胞壁中的二氨基庚二酸(diaminopimelic acid，DAP)，从而影响细胞壁的完整性。带有asd基因的质粒和asd－的沙门氏菌构成平衡致死体系，仅转化有asd+质粒的沙门氏菌在体内才能生存，而未转化的沙门氏菌则死亡［10］。单纯asd突变株并不减毒，而使用△asd、△aro突变的沙门氏菌，既有减毒性，又可防止空载体沙门氏菌在机体内的存在。
1.4 其它减毒基因 除以上常见的减毒基因外，还包括有htrA基因编码热休克蛋白，cya、crp基因分别编码腺苷酸环化酶和环腺苷酸受体蛋白，突变调控基因转录的非特异性酸性磷酸酶phoP基因、调节膜孔蛋白(porin)表达的ompR基因等。
对于沙门氏菌的减毒，目前也已做了大量的研究。在使用沙门氏菌活疫苗时，首先必须考虑到安全问题，其次是没有反应原性和有免疫原性间的平衡关系问题［9，11］，因此构建一种基因不连续的减毒双突变株，可以防止毒力返强的可能性，这一点非常重要。从芳香族(aro)氨基酸合成途径基因突变的减毒菌株在小鼠、牛、绵羊、鸡上使用来看确实有效果，在人志愿者试验中也显示了很大的应用前景［12，13］。
2 减毒沙门氏菌载体激发的免疫应答
疫苗免疫接种后要取得好的预防效果，刺激产生正确的免疫应答类型是十分重要的。其中除抗原的内在特性外，接种的途径和形式也会影响免疫效力和获得性免疫应答的质量。此外，大部分的病原进入机体的途径是消化道，为了阻止这些病原定居消化道和引发全身性疾病，需要通过黏膜途径接种疫苗抗原，激发局部的黏膜免疫，刺激全身性的细胞免疫和体液免疫，从而达到预防疾病的目的。减毒肠道微生物作为疫苗抗原的传递系统就可以解决以上问题。将细菌、病毒或寄生虫等具有抗原性蛋白的外源基因克隆到表达质粒中，然后将该重组质粒转入减毒沙门氏菌，用此重组减毒沙门氏菌对动物和人进行经黏膜免疫(口服或鼻腔免疫)。在鼻腔，减毒沙门氏菌侵入GALT淋巴组织;而在肠道，减毒沙门氏菌穿过GALT淋巴组织区域中的M细胞，侵入M细胞所覆盖下的集合淋巴结结构。减毒沙门氏菌在GALT和GALT淋巴组织的巨噬细胞中可诱导表达外源抗原并传递给APC，诱发免疫细胞应答，在局部黏膜处形成特异的针对外源抗原的SIgA。同时，减毒沙门氏菌亦可侵入脾、肝、肾等多处淋巴结，诱发全身性针对外源抗原的体液免疫和细胞免疫，但以黏膜处产生的免疫作用最有效，能阻止细菌、病毒和寄生虫入侵黏膜处而导致感染［14］。另外一种可能的机制是重组减毒沙门氏菌引起吞噬它的APC凋亡，凋亡产物(可含有目的抗原DNA疫
苗)被邻近的APC吞噬。Yrlid等［15］在体外实验中发现鼠伤寒沙门氏菌4028可诱导髓源巨噬细胞凋亡，作为“旁观者”的巨噬细胞和DC都可吞噬凋亡产物。
3 减毒沙门氏菌进入机体免疫系统的机制
3.1 黏膜上皮M细胞的粘附与免疫应答 减毒沙门氏菌是一种兼性胞内菌，可引起隐性感染、局部胃肠炎甚至整个肠道疾病。通常感染由侵袭性细菌穿过小肠上皮引起。肠黏膜上皮细胞间存在紧密连接，且在固有层细胞表面存在刷状缘，病原体不能直接接触上皮细胞，所以大部分病原体主要通过特殊的黏膜上皮M细胞进入机体［16］。M细胞主要集中在派伊尔结(Payer，s pathches，PPs)下的滤泡相关上皮中，其主要功能是穿过上皮屏障将抗原物质转运至细胞内，从而产生由上皮内或上皮下淋巴细胞介导的初级免疫应答。减毒沙门氏菌通过M细胞进入黏膜下淋巴组织后可激活Th2细胞产生大量的IL－5，它能活化B细胞，使其分化为浆细胞，在产生Ig的过程中发生向IgA的类型转换。肠黏膜上皮细胞还能产生分泌小体与双体IgA分子结合，形成分泌型IgA(SIgA)分泌到肠黏膜表面，SIgA能抵抗肠道蛋白酶的分解作用，形成黏膜上的局部抗体，在黏膜免疫中起重要作用。固有层CD4+T细胞受到细菌抗原物质的激活，能产生干扰素增强单核巨噬细胞的吞噬作用，从而
杀灭细胞内的寄生物，起到细胞免疫作用。一般减毒的沙门菌仍有良好的侵袭力，因此它进入机体的方法与野毒株相似，都是穿过M细胞进入机体，但减毒后毒力明显下降，对M细胞的细胞毒作用可能没有或很小。具侵袭力的沙门氏菌可选择性地入侵PPs的M细胞并破坏M细胞，然后被位于上皮下穹隆区的抗原提呈细胞(antigen presentingcells，APC)捕获［17］，之后，APC 再与相关免疫细胞相互作用，从而产生局部黏膜免疫、体液免疫以及细胞免疫应答。
3.2 减毒沙门氏菌被树突细胞直接从肠腔摄取进入机体 减毒沙门氏菌除了通过M细胞进入机体外，还可以被树突状细胞(Dendritic cell，DC)直接摄取进入机体。DC是抗原递呈细胞，在启动获得性免疫中起重要的作用。DC一般定植于抗原暴露的位置，当在外围遇到抗原时就会移行到次级淋巴器官并在那里与T细胞相互作用。在外围组织的DC还处于不成熟状态，这种DC能够捕获抗原包括细菌，但不能高效刺激T细胞。未成熟的DC必须经过特殊的改造从而达到成熟，并在此过程中获得高效激活T细胞的能力［18］。DC和脾DC子集都能加工沙门氏菌和直接递呈源自沙门氏菌编码抗原的肽段到CD4+T和CD8+T细胞。Rescigno M 等［19］也发现DC可以携带细菌穿过肠上皮单层细胞，在此过程中，DC将其树突伸出上皮外，进入肠腔，将微生物等抗原物质摄入机体。Hopkins S A等［20］还发现
DC在体内也能摄取细菌，包括致病菌和非致病菌。被DC摄取后的抗原物质，能在DC中存活较长时间。DC能在体内有效加工抗原并将抗原递呈给T细胞，从而启动免疫应答。
4 减毒沙门氏菌的应用
以减毒沙门氏菌为载体的疫苗已经在很多领域内获得应用，尤其是载体－宿主平衡致死系统构建成功以来，减毒沙门氏菌载体疫苗的研究更加受到关注。有人用营养缺陷型沙门氏菌突变株SL7207运送gp100DNA载体疫苗来抵抗恶性黑素瘤病［21］，有人用X4072(asd－、cya－和crp－)构建了表达幽门螺旋杆菌黏附素的减毒疫苗［22］。总之，目前国内外学者已相继研制了肺炎链球菌、宋内志贺菌、结核分支杆菌、孤菌、百日咳杆菌、鼠疫耶尔森菌、牛布鲁菌、破伤风梭菌、沙眼衣原体和猪肺炎支原体、甲乙丙型肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒、单纯疱疹病毒、伪狂犬病病毒、流感病毒、血吸虫、疟原虫以及肿瘤等疾病的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌疫苗［23～25］。但也许是因为活载体疫苗还没有真正做到完美无缺，其在现实生活中的应用并不普遍，虽然网络中和文献资料中时有其身影闪现，但在药店柜台上和医院药房里却很少见。
5 减毒沙门氏菌载体疫苗的优越性及潜在危险性
首先，抗原呈递的有效性，减毒沙门氏菌载体疫苗的抗原递呈效率高于以往其他的DNA疫苗细菌载体，而且减毒沙门氏菌的脂质体类物质和来自细菌DNA的非未甲基化的基序(motif)还可以发挥免疫佐剂的作用，大大增强疫苗的免疫原性。免疫简单易行，一般一次口服免疫即可诱导较强的免疫保护反应［26］。其次，以减毒沙门氏菌为载体的疫苗免疫具有持续性和多联性，其在体内寄生和有限增殖时期，表达的外源蛋白对宿主持续刺激，能有效地长期激发机体产生免疫反应，可省去反复多次的加强免疫。并且可将若干种抗原克隆到同一质粒上进行联合免疫。第三，减毒沙门氏菌载体疫苗制备简单，不需提纯抗原，易储存运输，能激发比较全面的体液免疫、细胞免疫和黏膜免疫反应，显著降低疫苗的制作成本。
虽然减毒沙门氏菌载体疫苗有诸多优点，但仍存在一些不足。其一，制备疫苗使用的菌株尽管是减毒株，可能仍存在微弱的致病性，且革兰氏阴性菌在体内表达产生的脂多糖毒素可能对宿主细胞有毒性，可能会干扰编码基因在宿主细胞中的正确表达和合成，但目前还没发现减毒沙门氏菌载体(革兰氏阴性菌)有毒副作用，革兰氏阳性菌也没这些毒副作用。其二，质粒DNA可能会整合到宿主细胞基因组，从而引起调控细胞生长的基因紊乱、原癌基因和抑癌基因的表达失控、体细胞癌变、细胞转型等一系列问题。如用弱毒L.manocyto
gene为载体的DNA疫苗中已发现低水平的整合现象，这主要是转染至单个细胞的质粒拷贝数太多引起的，另外也发现细胞毒性T细胞可缓解甚至消除整合作用［27］。
豫公网安备41160202000603
站长QQ:729038198
关于我们
投诉建议