3种条件性致病菌三重PCR检测方法的建立及初步应用 冯洁;谢建云;胡建华;高诚
【摘 要】本研究旨在建立一种能同时检测金黄葡萄球菌(Staphylococcus aureus,S.aureus)、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa,P.aeruginosa)、肺炎克雷伯杆菌(Klebsiella pneumoniae,K.pneumoniae)的三重PCR检测方法.根据金黄葡萄球菌nuc基因、绿脓杆菌toxR基因、肺炎克雷伯杆菌PhoE基因设计并合成引物,在单一PCR条件基础上优化建立三重PCR反应条件,并进行特异性、敏感性和重复性分析及与细菌分离培养的比对试验.结果显示,3对引物均能特异性扩增出目的条带,大小分别为484、278和368 bp.最佳退火温度在56～59℃之间,引物浓度均为0.2 μmol/L,dNTP浓度为200 μmol/L,Mg2+浓度为2.5 mmol/L.3种细菌间无交叉反应.对支气管鲍特杆菌等其他8种实验动物常见致病菌均无交叉反应.最低能同时检测到10-5 ng/μL的细菌基因组DNA.3次重复结果一致,表明建立的三重PCR方法重复性好.同时采用细菌分离培养法和三重PCR方法对30份实验小鼠样本进行检测,对比结果显示三重PCR方法检出率略高于细菌分离培养法,细菌分离培养法呈阳性的样品,三重PCR方法均能检出.结果表明,本试验建立的三重PCR检测方法具有特异、敏感、高效等优点,为实验动物细菌快速检测和流行病学调查提供了技术支持. 【期刊名称】《中国畜牧兽医》
【年(卷),期】2015(042)006
【总页数】7页(P1389-1395)
【关键词】三重PCR;金黄葡萄球菌;绿脓杆菌;肺炎克雷伯杆菌
【作 者】冯洁;谢建云;胡建华;高诚
【作者单位】上海实验动物研究中心,上海市实验动物质量监督检验站,上海201203;上海实验动物研究中心,上海市实验动物质量监督检验站,上海201203;上海实验动物研究中心,上海市实验动物质量监督检验站,上海201203;上海实验动物研究中心,上海市实验动物质量监督检验站,上海201203 【正文语种】中 文
【中图分类】Q78
江口涣实验动物微生物质量控制是评价实验动物质量的重要指标之一，中国实验动物微生物等级及监测标准GB／T14922.2—2011 中明确规定，金黄葡萄球菌（Staphylococcus aureus，S.aureus）、绿脓杆菌（Pseudomonas aeruginosa，P.aeruginosa）、肺炎克雷伯杆菌（Klebsiella pneumoniae，K.pneumoniae）是无特定病原体级（specific pathogen free，SPF）实验大、小鼠必须检测和排除的项目。这3种细菌均属于条件性致病菌，是指正常存在于动物体内，在免疫功能低下的情况下，定居部位改变或失调等特定情况下引起感染的微生物，分布较广，主要通过接触和空气传播，以潜伏感染为主，对于免疫系统受损的宿主，常表现为感染、炎症甚至死亡［1－3］，严重影响实验动物质量，干扰试验结果。纵观近年来中国实验动物质量监测的情况来看，金黄葡萄球菌、绿脓杆菌等条件性致病菌阳性屡见不鲜［4－6］。当前中国实验动物微生物检测国标针对上述3种细菌推荐的检测手段是传统的细菌分离培养、生化鉴定，耗时需3～7d，操作繁琐且检测结果易受检测人员的主观判定干扰。因此，建立快速、敏感、易于标准化操作的检测方法显得尤为重要。
1 材料与方法
1.1 菌株
金黄葡萄球菌ATCC 6538、绿脓杆菌ATCC27853、支气管鲍特杆菌ATCC 14065、嗜肺巴斯德杆菌ATCC 35149、肺炎链球菌ATCC 6503均购自美国标准生物品收藏中心。肺炎克雷伯杆菌CMCC 46117、鼠伤寒沙门氏菌CMCC 50115、表皮葡萄球菌CMCC 26069、乙型溶血性链球菌CMCC 32210、福氏志贺菌CMCC 51572、粪产碱杆菌CMCC 40001均购自中国医学微生物菌种保藏管理中心。
表1 引物序列Table 1 The primer sequences细菌 基因 引物序列（5′→3′） 产物长度（bp）Bacteria GenesPrimer sequencesFragment length金黄葡萄球菌S.aureus nuc SA1：CTTTAGCCAAGCCTTGACGAAC 484 SA2：AAAGGGCAATACGCAAAGAGGT绿脓杆菌P.aeruginosa toxR PA1：GCACCCGCAACGCATCAA 278 PA2：CCTGGAAAGGCTCCGAATAGTG肺炎克雷伯杆菌K.pneumoniae PhoE KP1：TGGCCCGCGCCCAGGGTTCGAAA 368 KP2：GATGTCGTCATCGTTGATGCCCAG
1.2 主要试剂
vrml实例血琼脂平皿、营养肉汤、NAC培养基、细菌生化鉴定管、琼脂粉均购自上海伊华医学科技有限公司；高盐甘露醇平皿、DHL平皿均购自上海科玛嘉微生物技术有限公司；细菌基因
组DNA 提取试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司；Taq DNA 聚合酶、PCR Buffer、Mg2＋、2×Taq Plus Master Mix（Dye Plus）、DL2000DNA Marker均购自南京诺唯赞生物科技有限公司；琼脂糖购自西班牙Bio－West公司；GoldViewTM核酸染料购自上海赛百盛（SBS）基因技术有限公司。
1.3 引物设计与合成
根据GenBank 已公布的金黄葡萄球菌nuc基因、绿脓杆菌toxR 基因、肺炎克雷伯杆菌PhoE基因序列，参照文献［7－8］设计引物（表1）。引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。
the catalyst
1.4 PCR模板制备
周昌贡金黄葡萄球菌、绿脓杆菌、肺炎克雷伯杆菌等菌种分别接种至营养肉汤，36 ℃培养过夜后，按试剂盒说明书要求提取细菌基因组DNA，获得DNA样品于－20 ℃保存备用。
1.5 单重PCR 反应
螨类
PCR 反应体系50μL，包括2×Taq Plus Master Mix（Dye Plus）25μL，其中Mg2＋终浓度为2.0mmol／L，dNTP 终浓度为200μmol／L，引物各0.2μmol／L。
PCR 反 应 程 序：95 ℃预 变 性5min；95 ℃变 性30s，退火30s，72 ℃延伸30s，34个循环；72 ℃延伸10min。退火温度变化范围设置为48～60 ℃。
PCR 扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测分析。选取PCR 阳性产物送至生工生物工程（上海）股份有限公司，经凝胶电泳纯化回收后进行测序。
1.6 三重PCR 反应条件优化
参照单重PCR 反应条件，设置48～60 ℃退火温度范围，退火温度分别为48.3、50.4、53.3、54.7、56.1、57.6、58.9、59.7 ℃，确定最佳退火温度。在此基础上对引物浓度、dNTP 浓度、Mg2＋浓度等参数进行优化。3对引物等体积加入，设置每条引物的终浓度分别为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6μmol／L，dNTP终浓度分别为100、150、200、250、300、350、400μmol／L，Mg2＋终浓度分别为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0mmol／L。
1.7 三重PCR 特异性试验
为检测引物的特异性，相互之间是否产生交叉反应，用优化好的三重PCR 反应条件，体系中加入3对引物，设计不同的模板组合，对三重PCR 特异性进行检测，模板组合包括单菌，两种菌组合：金黄葡萄球菌／绿脓杆菌、金黄葡萄球菌／肺炎克雷伯杆菌、绿脓杆菌／肺炎克雷伯杆菌及3种菌组合：金黄葡萄球菌／绿脓杆菌／肺炎克雷伯杆菌。
同时，按1.4所述模板制备方法提取支气管鲍特杆菌ATCC 14065、嗜肺巴斯德杆菌ATCC 35149、肺炎链球菌ATCC 6503、鼠伤寒沙门氏菌CMCC 50115、表皮葡萄球菌CMCC 26069、乙型溶血性链球菌CMCC 32210、福氏志贺菌CMCC 51572、粪产碱杆菌CMCC 40001基因组DNA 后，进行三重PCR 扩增，以判定该方法对其他细菌是否会发生非特异性扩增。
1.8 三重PCR 敏感性试验
分别测定3 种细菌DNA 模板浓度，调整至1ng／μL，再以此为基础进行10 倍梯度稀释，终浓度为100、10－1、10－2、10－3、10－4、10－5、10－6、10－7、10－8、10－9 ng／μL，各个菌株每个梯度各取1μL 加到三重PCR 体系中，进行敏感性测定。
1.9 三重PCR 重复性试验
随机选取4份DNA 样品，分别设置3 个平行反应管，进行三重PCR 扩增，对扩增结果进行对比。
1.10 对比试验
采集30份实验小鼠回盲部内容物，按国家标准GB／T14926—2001《实验动物 微生物学检测方法（1）（2）》进行金黄葡萄球菌、绿脓杆菌、肺炎克雷伯杆菌的分离培养及鉴定。同时取上述回盲部内容物0.2g，悬浮于1mL PBS（pH 7.4）中制成细菌悬液，按照细菌基因组DNA 提取试剂盒说明书严格操作，提取DNA 模板，采用本试验建立的三重PCR方法进行检测，并将分离培养结果与三重PCR 结果进行对比。
传感器数据采集系统2 结果与分析
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