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高梅“2，曹冲、王功霞\马会\英永”
1.山东省药学科学院山东省化学药物重点实验室，山东济南250101
2.山东师范大学生命科学学院山东省动物抗性生物学重点实验室，山东济南250014
摘要：A m e s试验是一项体外致突变性试验，被广泛用于药物、食品、化学品和农药的遗传毒性检测，以评价受试物致突 变的可能性。药物、食品、化学品和农药的指导原则和国家标准中A m e s试验方法不尽相同，就这几者A m e s试验方法的主 要异同点进行比较分析，以期能熟练掌握A m e s试验实施要点，更加规范实施检测工作，不断提高试验质量。
关键词：A m e s试验；药物；食品；化学品；农药
中图分类号：R962.2 文献标志码：A文章编号：1674-6376 (2021) 03-0672-05
D O I：10.7501/j.issn. 1674-6376.2021.03.031
Comparison and analysis of Ames test for genotoxicity evaluation
GAO Mei12,CAO Chong1,WANG Gongxia1,MA Hui1,YING Yong1
2015年新年寄语
1. S h a n d o n g A c a d e m y of Pharmaceutical Sciences, S h a n d o n g Provincial K e y Laboratory of C h e m i c a l Drug, Jinan 250101, China
2. S h a n d o n g N o r m a l University, College of Life Sciences, S h a n d o n g Provincial K e y Laboratory of A n i m a l Resistance Biology,
Jinan 250014, China
A b str a c t:A m e s test is a mutagenicity test in vitro, w h i c h i s widely used in the detection of genotoxicity of drugs, food, chemicals and pesticides to evaluate the possibility of mutagenicity of test substance. T h e guiding principles an d national standards of A m e s test on drugs, food, chemicals and pesticidesand are different. In this paper, the m a i n similarities and differences w ere c o m p a r e d and analyzed in order to master the key points of A m e s test implementation, so w e can i m p l ement the testing w o r k standardly and improve the test quality constantly.
K ey w o r d s:A m e s test; drugs; food; chemicals; pesticides
细菌回复突变试验又称Am es试验，是一项检 测基因突变的体外致突变性试验，以评价受试物致 突变的可能性。Ames试验周期短、方法相对简单、结果直观明了，被广泛用于药物、食品、化学品和农 药的遗传毒性检测。《药物遗传毒性研宄技术指导 原则》（2018年)n]、GB 15193.4—2014《食品安全国 家标准细菌回复突变试验》m、GB/T21786—2008 《化学品细菌回复突变试验方法:P]、GBZ/T240.8—2011《化学品毒理学评价程序和试验方法第8部分：鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验》[4]、GB/T 15670.14—2017《农药登记毒理学试验方法第14 部分：细菌回复突变试验》[5](以下简称食品、化学 品、农药Ames试验标准）中，都有对Am es试验的介绍，但试验方法不尽相同，本文根据现行的指导原 则和国家标准，对A m es试验方法的主要异同点进 行比较分析，以便研究人员熟练掌握Ames试验实 施要点，制定出在实际工作中可行的标准操作规程 或作业指导书等，更加规范地实施检测工作，提高 试验质量。
《药物遗传毒性研究技术指导原则》和食品、化 学品Ames试验标准推荐的菌株组合均为5种：（1) 鼠伤寒沙门氏菌TA98; (2)鼠伤寒沙门氏菌TA100; (3)鼠伤寒沙门氏菌TA1535;(4)鼠伤寒沙 门氏菌TA153 7或TA97或TA97a;(5 )鼠伤寒沙门氏 菌TA102或大肠埃希杆菌WP2 uvrA或大肠埃希杆
收稿日期：2020-06-02
基金项目：山东省创新公共服务平台项目（2015C X P T00001)
第一作者：高梅（1983 —)，女，副主任药师，研究方向为药物安全性评价。E-mail:***************** *通信作者：英永（1980—），男，副主任药师，研宄方向为药物安全性评价。
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菌WP2uvrA(pKM101)。农药Ames试验标准推荐 使用鼠伤寒沙门氏菌TA97、TA98、TA丨00、TA102作为4株标准测试菌株，必要时可增加TA1535、TA1537、TA97a、大肠杆菌WP2 uvrA或大肠杆菌 WP2uvrA(pKM101)任一菌株，也可采用上述的菌 株组合。
2菌株鉴定
2.1鉴定项目
《药物遗传毒性研宄技术指导原则》(2018年）规定菌株特性鉴定需符合要求，对鉴定项目未详细 规定。食品、化学品、农药细菌回复突变试验方法 则规定需对菌株进行组氨酸缺陷型(h i)的鉴定、脂多糖屏障缺陷（rfa)的鉴定、uvrB修复缺陷型的鉴 定、R因子(抗氨苄青霉素）的鉴定、四环素抗性的鉴 定、生物素缺陷型（bio_)的鉴定、自发回变率的测 定，并且对鉴定频次、鉴定方法也有详细介绍。此 外，食品、化学品还规定对菌株进行阳性致突变物 敏感性的鉴定，农药则未规定。
2.2鉴定频次
《药物遗传毒性研宄技术指导原则》(2018年）未提及菌株鉴定的频次。食品Ames试验标准规定 每3个月进行一次菌株鉴定，遇到下列情况也应进 行菌株鉴定：在收到培养菌株后；当制备一套新的 冷冻保存或冰冻干燥菌株时；重新挑选菌株时；使 用主平板传代时。化学品规定新获得的或长期保 存的菌种，在试验前必须进行菌株鉴定。农药 Ames试验标准则规定，下列情况应进行菌株鉴定：在收到培养菌株后；当制备一套新的冷冻保存或冰 冻干燥菌株时；当每皿自发回变数不在正常范围 时；当对标准诱变剂丧失敏感性时；初次投入使 用前。
虽然食品、化学品、农药对菌株的鉴定频次不 尽相同，但目的都是为保证试验时菌株特性符合 要求。
2.3鉴定方法
食品、化学品、农药菌株鉴定项目试验方法大 致相同，在以下2个项目存在差别。
2.3.1 his_的鉴定食品、化学品、农药Ames试验 标准对菌株his_的鉴定方法及判定标准相同，均是 取菌液分别划线接种于含组氨酸和不含组氨酸的 培养基平皿上，菌株在含组氨酸培养基平板表面上 生长，可长出一条菌膜，而在无组氨酸培养基平皿 上则不能生长或仅有少量增长，除自发回变菌落外 无菌膜。不同的是，食品、农药要求37 °C培养48 h，化学品则37 °C培养24 h。
2.3.2 rfa的鉴定食品、农药对rfa的鉴定方法是，加热融化营养肉汤琼脂培养基。取菌液0.1m L移入平板，迅速将营养肉汤琼脂培养基(50 °C左右）适 量倒入平皿，混匀，平放凝固。将无菌滤纸片1片放 入己凝固的培养基平皿中央，在滤纸片上滴加0.1% 结晶紫溶液10 HL,37 °C培养24 h。
化学品对菌株rfa的鉴定方法是，取0.1m L增菌液加到2 mL45 °C己融化的顶层琼脂中，摇匀后 倒在营养肉汤的底层琼脂培养基上，待琼脂凝固 后，在平皿中央放一直径为6 m m的圆滤纸，然 后将1mg/m L结晶紫溶液l〇n L滴在滤纸上，37°C 培养24h。
三者虽然鉴定方法不同，但是判定标准相同，都是观察待测菌株在滤纸片周围能否出现1个透明 的抑制圈，若有则说明该菌株具有rfa突变。
3活化系统
药物、化学品Ames试验标准中，S9在S9混合 液中的浓度一般为5%〜30%；食品Ames试验标准 中，S9可在4%〜30%中确定最适用量；农药Ames 试验标准则直接规定S9浓度为10%。
4培养基和试剂
《药物遗传毒性研宄技术指导原则》中未说明 Am es试验中各种试剂的配制方法。食品、化学品、农药Am es试验标准中对营养肉汤培养基、营养肉 汤琼脂培养基、底层培养基、顶层培养基、S9混合
液、菌株鉴定所需试剂等配制方法均进行了详细介 绍。其中，食品和农药中各种试剂配制方法、各成 分的最终浓度或含量基本相同，不同的是食品中辅 酶-II(氧化型）溶液和葡萄糖-6-磷酸钠盐溶液要求 现用现配，农药中则可-20 °C以下低温保存。
5剂量设计
药物、食品、化学品、农药Am es试验标准中对 最高测试浓度和剂量的选择上是-致的，均规定至 少应选用5个可用于结果分析的浓度，最高测试 浓度为5 mg/皿或5 nL/皿，分别在加和不加S9的条件下进行试验，每个剂量3个平皿。对于最高剂 量下的其他剂量的设定，《药物遗传毒性研究技术 指导原则》中未提及；食品中规定按等比组距的原 则设立剂量间隔，推荐采用\/顶倍组距；化学品中 剂量间隔一般为半对数（如，丨万），也可采用更小的 剂量间隔；农药中则规定剂量可按0.5〜5 000.0 ng/皿 设定，也可根据预试验结果按等比组距设定。《药物 遗传毒性研宄技术指导原则》中，中药、天然物试验
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时，可根据具体情况进行合理设计；食品、化学品、农药A m e s试验标准中，评价含有潜在致突变杂质的 受试物时，试验剂量可高于5 m g/皿或5 p L/皿，食品 最低剂量不低于0.2 n g/皿，农药最低剂量可考虑为0.1 (ig/皿。
6溶媒
《药物遗传毒性研宄技术指导原则》(2018年）未提及溶媒的选择原则。食品、化学品、农药对溶 媒的选择原则是一样的，溶媒应不与受试物发生反 应，对所选菌株和S9没有毒性，没有诱变性。首选 蒸馏水，对于不溶于水的受试物可选择其他溶媒，首选D M S O。但对D M S O的用量，食品规定每平皿 最高添加量不超过0.1m L，农药则规定不得超过0.4 m L，化学品未规定。
7对照组设定
药物、食品、化学品、农药A m e s试验标准中，都 规定溶媒对照和阳性对照是必须设立的。食品还 规定，未处理对照组（空白对照组）也必须设定，化 学品、农药中，如果历史资料证实所选择的溶剂无 毒性或无致突变作用，空白对照组非必须设立。
8试验方法
《药物遗传毒性研宄技术指导原则》规定试验 可采用标准平板掺入法或预培养法，受试物处理后 48〜72 h观察结果；食品A m e s试验标准中，试验方 法有平板掺入法、预培养平板掺入法(培养48〜72 h 观察结果）、点试法（培养48 h观察结果）；化学品可 采用平板掺入法或预孵育法，培养48〜72 h；农药试 验方法有平板掺入法、预培养平板掺入法、点试法，均培养48 h观察结果。
9重复试验
2007版的《药物遗传毒性研究技术指导原则》规定试验需重复1次，2018版的指导原则未提及。
G B 15193.4—2014《食品安全国家标准细菌回复突 变试验》、G B/T 15670.14—2017《农药登记毒理学 试验方法第14部分：细菌回复突变试验》、G B/T 21786—2008《化学品细菌回复突变试验方法》规 定，明显的阳性结果不需要进行验证，可疑的结果 要改用其他的方法进行验证，阴性结果需要验证。《食品安全国家标准细菌回复突变试验》中，阴性结 果验证应改变试验的条件；《农药登记毒理学试验 方法第14部分：细菌回复突变试验》《化学品细菌 回复突变试验方法》中，如阴性结果无需进行验证，应说明理由；G B Z/T240.8—2011《化学品毒理学评 价程序和试验方法第8部分：鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验》则规定，试验至少重复1次。
10结果判定
《药物遗传毒性研宄技术指导原则》(2018年）、《化学品细菌回复突变试验方法》中，受试样品经5 个试验菌株检测后，至少在1个菌株上，在有或无代 谢活化的情况下，受试物所诱发的回复突变菌落数 出现浓度相关性的增加和（或）在一个或多个浓度 组上出现可重复性的增加，可判定为阳性结果。结 果判定时应首先考虑试验结果的生物学意义，统计 方法有助于结果的评价。《食品安全国家标准细菌 回复突变试验》中，对掺入法结果的评价是，测试菌 株T A1535、T A1537、T A98和大肠
杆菌的回变菌落 数等于或大于未处理对照组的2倍，其他测试菌株 的回变菌落数等于或大于未处理对照组的2倍并具 有以下两种情况之一的可判定为阳性结果：有剂量-反应关系；某一测试点有可重复的阳性结果。《农药 登记毒理学试验方法第14部分：细菌回复突变试 验》中，测试菌株T A1535、T A1537及大肠杆菌的受 试物组回变菌落数等于或大于阴性对照组的平均 数值的3倍，其他测试菌株的受试物组回变菌落数 等于或大于2倍阴性对照组回变菌落数，并有剂量- 反应关系，可判定为阳性结果；若某一测试点菌落 数增加是可重复的并有统计学意义的结果，也可判 定为阳性。《化学品毒理学评价程序和试验方法第8 部分：鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验》中，受试样品 诱发的回变菌落数超过自发回变菌落数2倍以上，并呈剂量-反应关系；受试样品经4个试验菌株检测 后，只要有1个试验菌株，无论在加S9或不加S9条 件下为阳性时，均可判定为阳性。
11结语及讨论
2018年颁布的《药物遗传毒性研宄技术指导原 则》，是进行药物遗传毒性研宄的基本原则，必须执 行《药物非临床研究质量管理规范》(G L P)，在试验 设计上，应在对受试物认知的基础上，遵循“具体问 题具体分析”原则，作为一个指导性文件，未对 A m e s试验方法细节进行详细的规定，试验时可根 据受试物己有信息选择合理的试验方法及设计适 宜的试验方案。《食品安全国家标准细菌回复突变 试验》、《化学品毒理学评价程序和试验方法第8部 分：鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验》、《农药登记毒 理学试验方法第14部分：细菌回复突变试验》则对 试验方法有详细的说明和规定，尽管方法
不尽相 同，但最终都是确保试验质量及对受试物的客观评价。
第 44 卷第 3 期 2021 年 3 月 名袷中河么 Drug Evaluation Research Vol. 44 No. 3 March 2021• 675 •
综上，A m e s 试验影响因素很多，要想获得好的 试验结果，可从以下几个方面进行质量控制：
(1)
试验菌株：在对不同受试物进行评价时，菌 株组合也各不相同，如TA 97a 、TA 98、TA 100、
TA 102、TA 1535 组合[6_8]，TA 97、TA 98、TA 100、 TA 102、TA 1535 组
合，TA 98、TA 100、TA 1535、 TA 1537、WP 2 uvrA 组
合
，TA 98、TA 100、TA 102、
TA 1535、TA 1537 组合[m5] , TA 97a 、TA 98、TA 100、 TA 1535、WP 2 uvrA 组合n 6]等，因菌株易变异及生物
学特性容易丢失，不论选用何种菌株组合，均应确 保菌株特性符合要求，同时，还应建立自己实验室 的回变菌落数历史背景值，以便在受试物的计数结 果有统计学意义时，可结合阴性对照历史范围综合 分析。
(2) S 9代谢活化系统：S 9
常用诱导剂为Aroclor
1254，因Aroclor 1254严重污染环境，现己停产，目 前可采用和P -萘黄酮联合诱导大鼠S 9肝 微粒体酶，活化效果与Aroclor 1254比较并无差 异[17~，制备后需对其蛋白含量和活性进行检测。 因自制方法较繁琐，大多试验室一般购买商品化
S 9，尽管所购买S 9有质检报告，己检测其含量和活
性，但笔者建议，如果条件允许，还是需要对S 9进行
活化效果考察。(3) 试剂配制：A m e s 试验中所需单个化学试剂 20余种，不同培养基又需要不同试剂的组合配制， 例如底层培养基需要6种试剂才能制得，氨苄青霉 素平板则在底层培养基的基础上又加入4种试剂， 配制方法琐碎，且试剂配制后均需高压灭菌或过滤 除菌，因此，试验过程需要耐心和细心，保证所配制 试剂的准确性及按要求进行储存，短期内使用。此 外，不同生产厂家的试剂品质也
各不相同，若实验 室己有较常用品牌试剂，尽量避免频繁更换。
再就业培训(4) 细菌培养：食品、化学品、农药A m e s 试验标 准中还规定试验时菌株活菌数不少于I X 109〜2X 109个/m L ，O E
C E
指导原则中也明确细菌数约
丨09个/m
L
[19]，因此，每个实验室均应建立菌株复苏、
冻存、培养等相关标准操作规程(S O P )及作业指导 书，以确认培养基、培养时间、震荡速率等条件因素 对细菌生长的影响。同时，在细菌培养、染毒过程 中，需小心操作，防止微生物污染，一旦污染，该组 数据将无法参与统计，严重者，试验需重新开展。
(5)
染毒：1个A m e s 试验，在加和不加S 9代谢
活化系统条件下，每个菌株均至少设7个组别，每组 平行3皿，共至少需要210管顶层培养基和210个底
层培养基平皿，共计需加样525次，若还有原研对 照、阴性对照等组别，则相应的需更多顶层、底层和 加样。染毒时，需在顶层培养基中分别加入增菌液
0.1 m
L
、受试物0.1 m
L
，需活化时再加S 9混合液0.5
m Lrcct
，混匀后倒入底层培养基平皿内，所以每个底层
培养基平皿均需标识清楚，染毒过程中需注意力集 中，不要漏加或多加，避免因加样失误导致结果不 准确。
细菌培养、试剂配制、加药染毒等试验过程，均 能影响A m e s 试验的质量。各实验室应在试验过程 中，不断总结经验，只有熟练掌握A m e s 试验实施过 程中各项要点，细心、科学地进行试验，才能提高
A m e s
试验的成功率及试验质量，为客观评价受试
物的毒性提供可靠数据。
利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突
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