化妆品安全技术规范
附件2
细菌回复突变试验
Bacterial Reverse Mutation Assay
1 范围
本规范确定了细菌回复突变试验的基本原则、要求和⽅法。
本规范适⽤于化妆品原料及其产品的基因突变检测。
2定义
2.1 回复突变 reverse mutation
细菌在化学致突变物作⽤下由营养缺陷型回变到原养型(prototroph)。
2.2 基因突变 gene mutation
分享的价值和意义
在化学致突变物作⽤下细胞D NA 中碱基对的排列顺序发⽣变化。
2.3 碱基置换突变 base substitution mutation
栅栏技术
引起D NA 链上⼀个或⼏个碱基对的置换。
碱基置换有转换(transition)和颠换(transversion)两种形式。
转换是D NA 链上的⼀个嘧啶被另⼀嘧啶所替代，或⼀个嘌呤被另⼀嘌呤所代替。
颠换是D NA 链上的⼀个嘧啶被另⼀嘌呤所替代，或⼀个嘌呤被另⼀嘧啶所代替。
2.4 移码突变 frameshift mutation
引起D NA 链上增加或缺失⼀个或多个碱基对。
2.5 细菌回复突变试验Bacterial reverse mutation assay
利⽤⼀组组氨酸或者⾊氨酸缺陷型试验菌株测定引起细菌碱基置换或移码突变的化学物质所诱发的氨基酸缺陷型→原养型回复突变的试验⽅法。 2.6 S9
经多氯联苯(PCB混合物)或苯巴⽐妥钠和β-萘黄酮结合诱导的⼤⿏制备肝匀浆，在9000g 下离⼼10min 后的肝匀浆上清液。
3 原理
⿏伤寒沙门⽒组氨酸营养缺陷型菌株不能合成组氨酸，故在缺乏组氨酸的培养基上，仅少数⾃发回复突变的细菌⽣长；⼤肠杆菌⾊氨酸营养缺陷型菌株不能合成⾊氨酸，故在缺乏⾊氨酸的培养基上，仅少数⾃发回复突变的细菌⽣长。假如有致突变物存在，则营养缺陷型的细菌回复突变成原养型，因⽽能⽣长形成菌落，据此判断受试物是否为致突变物。 某些致突变物需要代谢活化后才能引起回复突变，故需加⼊经诱导剂诱导的⼤⿏肝制备的S9混合液。
4 仪器和设备
培养箱、恒温⽔浴、振荡⽔浴摇床、压⼒蒸汽消毒器、⼲热烤箱、低温冰箱(-80℃) 或液氮
⽣物容器、普通冰箱、天平(精密度0.1g 和0.0001g)、混匀振荡器、匀浆器、菌落计数器、低温⾼速离⼼机，玻璃器⽫等。
5 培养基和试剂
5.1 0.5mmol/L 组氨酸-0.5mmol/L⾊氨酸-0.5mmol/L ⽣物素溶液 成分：L-组氨酸（MW155）78mg
D-⽣物素（MW244）122mg
L-⾊氨酸（MW204）102mg
加蒸馏⽔⾄1000ml
配制：将上述成分加热，以溶解⽣物素，然后在0.068MPa 下⾼压灭菌20min。贮于4℃冰箱。若试验中不使⽤⼤肠杆菌，则不添加⾊氨酸。
5.2 顶层琼脂培养基
成分：琼脂粉 1.2g
氯化钠 1.0g
加蒸馏⽔⾄ 200mL 配制：上述成分混合后，于0.103MPa 下⾼压灭菌30min。实验时，加⼊0.5mmol/L 组氨酸-0.5mmol/L⾊氨酸-0.5mmol/L ⽣物素溶液20mL。若试验中不使⽤⼤肠杆菌，则不
添加⾊氨酸。
连辟公府不就5.3 Vogel-Bonner (V-B) 培养基E
成分：枸椽酸(C6H8O7·H2O) 100g
磷酸氢⼆钾(K2HPO4) 500g
磷酸氢铵钠(NaNH4HPO4·4H2O) 175g
硫酸镁(MgSO4·7H2O) 10g
加蒸馏⽔⾄1000mL 配制：先将前三种成分加热溶解后，再将溶解的硫酸镁缓缓倒⼊容量瓶中，加蒸馏⽔⾄1000mL。于
0.103MPa 下⾼压灭菌30min。储于4℃冰箱。
5.4 20%葡萄糖溶液
成分：葡萄糖200g
加蒸馏⽔⾄1000mL 配制：加少量蒸馏⽔加温溶解葡萄糖，再加蒸馏⽔⾄1000mL。于0.068MPa下⾼压灭菌
20min。储于4℃冰箱。
5.5 底层琼脂培养基
成分：琼脂粉7.5g
蒸馏⽔480mL
V-B 培养基E10mL
20%葡萄糖溶液10mL 配制：⾸先将前两种成分于0.103MPa 下⾼压灭菌30min 后，再加⼊后两种成分，充分混匀倒底层平板。按每⽫25mL 制备平板，冷凝固化后倒置于37℃培养箱中24h，备⽤。 5.6 营养⾁汤培养基
成分：⽜⾁膏 2.5g
胰胨 5.0g
磷酸氢⼆钾(K2HPO4) 1.0g
加蒸馏⽔⾄500mL
配制：将上述成分混合后，于0.103MPa 下⾼压灭菌30min。储于4℃冰箱。
5.7 盐溶液(1.65mol/L KCl+0.4mol/L MgCl2)
成分：氯化钾(KCl) 61.5g
氯化镁(MgCl2·6H2O) 40.7g
加蒸馏⽔⾄500mL 配制：在⽔中溶解上述成分后，于0.103MPa 下⾼压灭菌30min。储于4℃冰箱。
5.8 0.2mol/L 磷酸盐缓冲液(pH7.4)
成分：磷酸⼆氢钠(NaH2PO4·2H2O) 2.965g
磷酸氢⼆钠(Na2HPO4·12H2O) 29.015g
加蒸馏⽔⾄500mL 配制：溶解上述成分后，于0.103MPa 下⾼压灭菌30min。储于4℃冰箱。
5.9 S9混合液
成分每毫升S9混合液
肝S9100µl
盐溶液20µl
灭菌蒸馏⽔380µl
0.2mol/L 磷酸盐缓冲液500µl
辅酶I I(NADP) 4µmol
6-磷酸葡萄糖(G-6-P) 5µmol 配制：将辅酶 II 和 6-磷酸葡萄糖置于灭菌三⾓瓶内称重，然后按上述相反的次序加⼊各种成分，使肝 S9加到已有缓冲液的溶液中。该混合液必须临⽤现配，并保存于冰⽔浴中。实验结束，剩余S9混合液应该丢弃。
5.10 菌株鉴定⽤和特殊⽤途试剂
5.10.1 组氨酸-⾊氨酸-⽣物素平板
成分：琼脂粉15g
蒸馏⽔ 934mL
(V-B)培养基E 20mL
20%葡萄糖 20mL
灭菌盐酸组氨酸⽔溶液(0.5g/100mL) 10mL
灭菌盐酸⾊氨酸⽔溶液(0.5g/100mL) 10mL
灭菌0.5mmol/L ⽣物素溶液6mL 配制：⾼压灭菌琼脂和⽔后，将灭菌20%葡萄糖，V-B 培养基、组氨酸溶液，加进热的琼脂溶液中（若试验中不使⽤⼤肠杆菌，则不添加⾊氨酸，同时蒸馏⽔改为944ml）。待溶液稍微冷却后，加⼊灭菌⽣物素，混匀，浇制平板。
5.10.2 氨苄青霉素平板和氨苄青霉素/四环素平板
成分：琼脂粉15g
蒸馏⽔ 930mL
(V-B)盐溶液20mL
第四范式20%葡萄糖20mL
灭菌盐酸组氨酸溶液（0.5g/100mL）10mL
假声唱法灭菌盐酸⾊氨酸⽔溶液(0.5g/100mL) 10mL
灭菌0.5mmol/L ⽣物素溶液6mL
氨苄青霉素溶液(8mg/mL 于0.02mol/LNaOH 中) 3.15mL
四环素溶液(8mg/mL 于0.02mol/L HCl 中) 0.25mL 配制：琼脂和⽔⾼压灭菌20min，将⽆菌的葡萄糖、VB 盐溶液、组氨酸溶液和⾊氨酸溶液，加进热的琼脂溶液中，混匀（若试验中不使⽤⼤肠杆菌，则不添加⾊氨酸，同时蒸馏⽔改为加940ml）。冷却⾄⼤约50℃，⽆菌条件下加⼊四环素溶液和/或氨苄青霉素溶液。
应该在倾注琼脂平板后⼏天内，制备主平板。
5.10.3 营养琼脂平板
成分：琼脂粉7.5g
营养⾁汤培养基500mL 配制：于0.103MPa 下⾼压灭菌30min 后倾注平板。
6 试验菌株及其⽣物学特性鉴定
6.1 试验菌株
采⽤以下菌株作为标准组合：
⿏伤寒沙门⽒菌TA1535；
⿏伤寒沙门⽒菌TA97或TA97a或TA1537；
⿏伤寒沙门⽒菌TA98；
⿏伤寒沙门⽒菌TA100；
⿏伤寒沙门⽒菌TA102 或⼤肠杆菌WP2uvr A或⼤肠杆菌WP2uvr A（pKM101）；
6.2 ⽣物学特性鉴定
新获得的或长期保存的菌种，在试验前必须进⾏菌株的⽣物特性鉴定。菌株鉴定的判断标准，如表1所⽰。
表1试验菌株鉴定的判断标准
6.2.1 组氨酸缺陷/⾊氨酸缺陷
原理：组氨酸缺陷型试验菌株本⾝不能合成组氨酸，只能在补充组氨酸的培养基上⽣长，⽽在缺乏组氨酸的培养基上，则不能⽣长。
⾊氨酸缺陷试验菌株本⾝不能合成⾊氨酸，只能在补充⾊氨酸的培养基上⽣长，⽽在缺乏⾊氨酸的培养基上，则不能⽣长。
鉴定⽅法：将测试菌株增菌液分别于含组氨酸或者⾊氨酸培养基平板和⽆组氨酸或者⾊氨酸平板上划线，于37℃下培养24h 后观察结果。
结果判断：组氨酸缺陷型菌株在含组氨酸平板上⽣长，⽽在⽆组氨酸平板上则不能⽣长；⾊氨酸缺陷型菌株在含⾊氨酸平板上⽣长，⽽在⽆⾊氨酸平板上则不能⽣长。
6.2.2 脂多糖屏障缺损
原理：具有深粗糙（rfa）的菌株，其表⾯⼀层脂多糖屏障缺损，因此⼀些⼤分⼦物质，如结晶紫能穿透菌膜进⼊菌体，从⽽抑制其⽣长，⽽野⽣型菌株则不受其影响。
鉴定⽅法：吸取待测菌株增菌液 0.1mL于营养琼脂平板上划线，然后将浸湿的 0.1%结晶紫溶液滤纸条与划线处交叉放置。37℃下培养24h 后观察结果。
结果判断：假若待测菌在滤纸条与划线交叉处出现⼀透明菌带，说明该待测菌株具有 rfa突变。
6.2.3 氨苄青霉素抗性
原理：含 R 因⼦的试验菌株对氨苄青霉素有抗性。因为 R 因⼦不太稳定，容易丢失，故⽤氨苄青霉素确定该质粒存在与否。
鉴定⽅法：吸取待测菌株增菌液 0.1mL，在氨苄青霉素平板上划线，37℃下培养 24h 后观察结果。
结果判断；假若测试菌在氨苄青霉素平板上⽣长，说明该测试菌具有抗氨苄青霉素作⽤，表⽰含R因⼦，否则，表⽰测试菌不含R因⼦或R因⼦丢失。
6.2.4 紫外线敏感性
原理：具有△uvr B/A突变的菌株对紫外线敏感，当受到紫外线照射后，不能⽣长，⽽具有野⽣型切除修复酶的菌株，则能照常⽣长。
如何创新社会管理鉴定⽅法：吸取待测菌株增菌液0.1mL于营养琼脂平板上划线，⽤⿊纸盖住平板的⼀半，置紫外灯下照射（15W，距离
33cm）8 秒钟。置37℃下孵育24h 后观察结果。
结果判断：具有△uvr B/A 突变的菌株对紫外线敏感，经辐射后细菌不⽣长，⽽具有完整的切除修复系统的菌株，则照常⽣长。
6.2.5 四环素抗性
原理：具有p AQI 的菌株对四环素有抗性。
鉴定⽅法：吸取待测菌株增菌液 0.1mL 于氨苄青霉素/四环素平板上划线，置 37℃下孵育 24h 后观察结果。
结果判断：假若测试菌照常在氨苄青霉素/四环素平板上⽣长，表明该测试菌株对氨苄青霉素和四环素两者有抗性，具有p AQI 质粒，否则，说明测试菌株不含p AQI 质粒。
6.2.6 ⾃发回变
原理：每种试验菌株都以⼀定的频率⾃发地产⽣回变，称为⾃发回变。这种⾃发回变是每种试验菌株的⼀项特性。
鉴定⽅法：将待测菌株增菌液 0.1mL 加到 2mL含组氨酸-⾊氨酸-⽣物素的顶层琼脂培养基的试管内（若试验中不使⽤⼤肠杆菌，则不添加⾊氨酸），混匀后铺到于底层琼脂平板上，待琼脂固化后，置37℃培养箱中孵育48h 后记数每⽫回变菌落数。
结果判断：每种标准测试菌株的⾃发回变菌落数应符合表1 要求。经体外代谢活化后的⾃发回变菌落数，要⽐直接作⽤下的略⾼。
6.2.7 回变特性-诊断性试验
原理：每种试验菌株对诊断性诱变剂回变作⽤的性质以及S9混合液的效应不⼀。
鉴定⽅法：按照平板掺⼊试验的操作步骤进⾏。将受试物换成诊断性诱变剂。
结果判断：标准菌株对某些诊断性诱变剂特有的回变结果参见表2。
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