结核杆菌抗原菌体免疫小鼠

结核杆菌菌体抗原免疫小鼠

实验方案的设计

立题依据

结核分枝杆菌（M. tuberculosis）简称为结核杆菌（tubercle bacilli）。本菌可侵犯全身各组织器官，但以肺部感染最多见。随着抗结核药物的不断发展和卫生生活状况的改善，结核的发病率和死亡率曾一度大幅下降。20世纪80年代后，由于艾滋病和结核分枝杆菌耐药菌株的出现、免疫抑制剂的应用、、贫困及人口流动等因素，全球范围内结核病的疫情骤然恶化。又成为了威胁人类健康的全球性卫生问题。

实验目的

制备结核杆菌的单价特异性抗体。

实验材料

1. 1　试剂与器材　生理盐水、酒精、碘酊、试管、吸管、三角烧瓶、离心机、剪刀、镊子

、注射器、离心管。

1. 2　无菌器皿的制备　试管、大平皿、三角烧瓶、注射器、吸管、离心管, 经洗液处理后, 用自来水冲洗干净, 再用蒸馏水冲洗3 次, 用纸包好后, 用干烤箱 ( 160℃) 干烤2 小时。

实验原理

汽车智能防盗系统抗血清为含有某一类具有特异免疫功能的抗体分子的血清，一般为动物被人工注射某类抗原后制备的动物血清。高效价的抗血清用于研究工作以及疾病的诊断和。

一种抗原能否引起抗体生成反应，一方面取决于抗原分子表面有无抗原决定簇（熊事件Antigenic determinant），另一方面取决于机体的免疫状态，当具备以上两个条件后，抗体生成将遵循抗体生成的一般规律——初次反应和再次反应。

实验步骤

一、制备免疫原

1、细菌的培养：用接种环挑取结核杆菌，放入肉汤培养基中培养。37℃培养24小时后，

用注射器吸取3ml菌液注入300ml肉汤培养基中，37℃振荡培养24小时。

2、比浊：1.175%BaCl2 0.5ml，1%H2SO4 99.5ml，制作比浊液。比浊标准为0.5麦氏比浊。

3、取菌液稀释至上述浊度：菌液细菌浓度为1×10ˆ9/L。

4、灭活：隔水煮沸2到2.5小时。

5、灭菌效果检查：取适量煮沸后的肉汤培养液涂布在琼脂培养基上，37℃培养24小时，看是否有菌落生长。

二、选择免疫动物并进行标记

选择家兔作为实验动物,挑选年龄在6个月以上当年繁殖的雄性,体重1-2公斤,健康家兔一只,免疫前用涂沫在动物的背部,作出明确的标记，避免混淆。

三、阴性对照标本的留取

1.采血方法

（1）静脉采血法：将家兔放在固定盒内，拔去拟采血部位的毛，用电灯照射加热或用电吹风吹热或用二甲苯棉球擦耳壳，使耳部血管扩张。用粗针头刺破耳缘静脉或以刀片在血管上切一小口，让血液自然流出即可。取血后用棉球压迫止血。亦可用针头插入耳线静脉取血，其操作步骤基本与耳缘静脉注射相似。最好有一助手帮助压紧耳根部，这样采血时比较容易。

（2）颈动脉放血:使动物仰卧固定四肢,颈部剪毛、消毒后纵向切开前颈部皮肤长约10cm,用止血钳将皮肤分开夹住,剥离皮下组织,露出肌层,用刀柄加以分离,即见搏动的颈动脉。小心将颈动脉和迷走神经剥离长约5cm,选择血管中段,用止血钳夹住血管壁周围的筋膜。远心端用丝线结扎,近心端用动脉钳夹住,用酒精棉花球消毒血管周围,用无菌剪刀剪一V形缺口。取长2.5cm、直径为1.6mm塑料管一段,将一端剪成针头样斜面,并将此端插入颈动脉中,另一端放入200ml无菌三角烧瓶内,然后放开止血钳,血即流入三角瓶内,动物流血至死,2.5公斤家兔可放血80~100ml。

（3）心脏取血:固定动物于仰卧位置,用食指探明心脏博动量高部位(在胸骨左侧,由下向上数第3 与第4肋骨之间,指兔),剪去少许毛,用2.5%碘酒和75%酒精消毒后,以9#针头在预定位

置与胸部呈 45°角刺入心脏,微微上下移动针头,待见血液进入针筒后,即将注射器位置固定取血。张鲁新2.5公斤体重的家兔一次可取血20~30ml。注入大平皿中。

2.血清的分离、保存

必须在无菌条件下进行,将三角烧瓶的血置37℃温箱1小时,再置4℃冰箱内3～4小时.待血液凝固血块收缩后,用毛细滴管吸取血清.于3000rpm离心15分钟,取上清加入防腐剂(0.01％硫柳汞或0.02％叠氮钠,最终浓度),分装后置4℃冰箱中保存备用.

四、免疫程序

第1次免疫（第六周）:取灭菌培养液0.1ml对家兔进行免疫,采取颈背部多点皮下注射。首次免疫接种时剂量不宜过大,过量或过少的免疫原都会导致免疫耐受。

第2次免疫（第八周）:间隔两周,取灭菌培养液0.2ml,采取耳缘静脉注射。

第3次免疫（第九周）:间隔一周,取灭菌培养液0.3ml,采取耳缘静脉注射。

第4次免疫（第十周）:间隔一周,取灭菌培养液0.5ml,采取耳缘静脉注射。

试血　在末次免疫后7天,在兔耳缘静脉取少量血,分离出血清后,用试管法检测抗体血清效价,如效价在1∶1280以上即可采血,如效价过低,可再加强注射。

五、动物采血法

1.采血方法

口。取长2.5cm、直径为1.6mm塑料管一段,将一端剪成针头样斜面,并将此端插入颈动脉中,另一端放入200ml无菌三角烧瓶内,然后放开止血钳,血即流入三角瓶内,动物流血至死,2.5公斤家兔可放血80~100ml。

（3）心脏取血:固定动物于仰卧位置,用食指探明心脏博动量高部位(在胸骨左侧,由下向上数第3与第4肋骨之间,指兔),剪去少许毛,用2.5%碘酒和75%酒精消毒后,以9#针头在预定位置与胸部呈 45。角刺入心脏,微微上下移动针头,待见血液进入针筒后,即将注射器位置固定取血。2.5公斤体重的家兔一次可取血20~30ml。注入大平皿中。

六、抗血清的鉴定

(一)双向免疫扩散法鉴定抗体的特异性

按双向免疫扩散技术打两排孔，上排放抗原粗提物(如抗原来自动物血清则放相应的混合血清和纯化抗原，下排加抗血清，进行双扩散18～24h后，仔细观察上下两排孔之间出现的沉淀线。若与粗抗原及纯抗原之间皆出现一条沉淀线，且两者互相融合，则证明该动物已产生单价特异性抗体；不出现沉淀线，表明示免疫成功。若与纯化抗原出现一条，而与粗

抗原出现多条线，且其中一条沉淀线与纯抗原沉淀线相连接，也是成功的免疫，待取血后将杂抗体吸收去除，可以成为单价特异性抗体。

(二)双向免疫扩散法则定抗血清效价

测定抗血清效价有两种稀释方法：一是稀释抗血清，如1/2、1/4、1/8、1/16对倍稀释，分别与一个浓度的纯抗原反应；另一是稀释抗原，即把抗原作对倍稀释或按浓度(如mg/ml)进行稀释，分别与不同浓度的抗血清进行双扩散试验(称为棋盘滴定)，见表10-1。

表10-1抗血清效价测定

抗原	抗血清
抗原	不稀释	1/2	1/4	1/8	1/16	1/32	1/64	1/128
不稀释	+++	+++	+++	++	++	+	-	-
1/2	+++	+++	+++	++	++	+	-	-
1/4	+++	+++	+++	++	++	+	- 低周波	-
1/8	+++	++	++	++	+	+	-	-
1/16	++	++	++	+	+	+	-	-
1/32	+	+	+	+	-	-	-	-
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