作物学报ACTA AGRONOMICA SINICA 2012, 38(3): 505-513 /zwxb/ ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9E-mail: xbzw@chinajournal
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2012.00505
满建民1蔡灿辉1严秋香2胡茂志2刘巧泉1,*韦存虚1,*
1扬州大学教育部植物功能基因组学重点实验室 / 江苏省作物遗传生理重点实验室, 江苏扬州 225009; 2扬州大学测试中心, 江苏
扬州 225009
摘要: 傅里叶变换红外光谱技术(FTIR)可用于研究淀粉粒的有序结构, 包括透射模式和衰减全反射模式2种。本文
探讨不同去卷积设置条件对FTIR波谱的影响, 并分析FTIR在淀粉粒有序结构分析中的应用。研究结果表明, 不同
去卷积设置对FTIR波谱和相关峰强度影响较大, 以半峰宽19 cm-1和增强因子1.9的设置对FTIR原始波谱去卷积,
获得的结果较好。天然淀粉晶体类型不同, 其FTIR波谱有差异, 表现在马铃薯和山药淀粉的衰减全反射FTIR波谱
相似, 与水稻淀粉明显不同; 水稻和马铃薯淀粉透射FTIR波谱相似, 与山药淀粉明显不同。淀粉中的水分含量影响
衰减全反射FTIR波谱, 当水分含量超过60%时, 对波谱分析结果基本没有影响。酸水解优先降解淀粉粒无定形区的
结构成分, 提高淀粉粒的有序度。淀粉葡糖苷酶水解淀粉对淀粉粒外部区域的有序度影响不大, 但明显提高整个淀粉
粒的有序度。不同品质稻米淀粉的衰减全反射FTIR波谱相似。上述研究结果为应用FTIR分析淀粉粒有序结构提供
重要的参考作用。
关键词：傅里叶变换红外光谱; 淀粉粒; 有序结构; 波谱去卷积
Applications of Infrared Spectroscopy in the Analysis of Ordered Structure of Starch Grain
MAN Jian-Min1, CAI Can-Hui1, YAN Qiu-Xiang2, HU Mao-Zhi2, LIU Qiao-Quan1,*, and WEI Cun-Xu1,*
1 Key Laboratories of Plant Functional Genomics of the Ministry of Education and Crop Genetics and Physiology of the Jiangsu Province, Yangzhou University, Yangzhou 225009, China;
中国对外贸易运输总公司
2 Testing Center, Yangzhou University, Yangzhou 225009, China
Abstract: Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR) is used to study the ordered structure of starch grain, which has two modes: transmittance and attenuated total reflectance (ATR). In this paper, the different deconvolution parameters of spectra were applied to compare their effects on FTIR spectra in studying the ordered structure of starch grain. The results indicated that the different deconvolution parameters had significant effects on FTIR spectra and the intensities of relative peaks. The peak half-width of 19 cm-1 and the resolution enhancement factor of 1.9 were ideal deconvolution parameters of spectra to obtain the better results. Native starches had A, B, and C three types of crystalline, their FTIR spectra showed some differences. Potato and Chinese yam starches had similar ATR-FTIR spectra, which were different from that of rice starch. However, rice a
nd potato starches had similar transmittance-FTIR spectra, which were different from that of Chinese yam starch. The water content of sam-
ple affected the spectra of ATR-FTIR, but this effect was not detected when water content exceeded 60%. The ATR-FTIR spectra showed that the hydrolysis of amorphous structure in starch grain was faster than that of ordered structure during acid treatment. The ordered degree of structure in starch grain increased with increasing time of acid hydrolysis. The amyloglucosidase hydrolysis had no significant effect on the ordered degree of structure at the outside of starch grain by the ATR-FTIR spectra, but the ordered degree of structure of whole starch grain significantly increased with enzyme hydrolysis according to the transmittance-FTIR spectra. The amylose content is an important physicochemical property in determining the starch quality. Rice starches with dif-ferent amylose contents showed the similar ATR-FTIR spectra. These results would be very useful for the application of FTIR to the analysis of ordered structure of starch grain.
Keywords: Fourier transform infrared spectroscopy; Starch grain; Ordered structure; Deconvolution of spectrum
本研究由国家自然科学基金项目(31071342)和江苏省作物学优势学科项目资助。
*通讯作者(Corresponding authors): 刘巧泉, E-mail: qqliu@yzu.edu; 韦存虚, E-mail: cxwei@yzu.edu
Received(收稿日期): 2011-08-22; Accepted(接受日期): 2011-12-15; Published online(网络出版日期): 2012-01-04.
URL: wwwki/kcms/detail/11.1809.S.20120104.1649.009.html
河南教育学院学报506作物学报第38卷
淀粉是植物主要的能量贮藏物质, 也是重要的食品来源和工业原料。植物淀粉以半晶态的颗粒形式存在于自然界, 包含结晶区和无定形区2种结构成分, 主要由直链淀粉和支链淀粉组成[1]。淀粉分子中的直链淀粉和支链淀粉中的短链部分形成了双螺旋结构, 又称为短程有序结构(short-range ordered structure), 这些双螺旋分子链通过分子间的相互作用力以一定的空间点阵在淀粉颗粒的某些区域形成不同的多晶形, 即晶体, 又称为长程有序结构(long- range ordered structure)[1-2]。依据粉末X-射线衍射波谱, 可将淀粉结晶结构分为A-型、B-型和C-型3种类型, 其中A-型晶体主要存在于禾谷类作物种子中, B-型晶体主要存在于植物块茎中和高直链作物种子中, C-型晶体由A-型晶体和B-型晶体共同组成, 主要存在于豆类作物种子和薯蓣类根状茎中[2]。
目前研究淀粉粒有序结构主要采用偏光显微镜技术(polarized light microscopy, PLM)、粉末X-射线衍射技术(X-ray powder diffraction, XRD)、13C CP/ MAS固体核磁共振技术(cross-polarization magic-angle spinning nuclear magnetic resonance, 13C CP/MAS NMR)和傅里叶变换红外光谱技术(Fourier transform in-frared spectroscopy, FTIR)[2-5]。PLM主要用于淀粉粒晶体结构存在有无的定性分析[3]。XRD检测淀粉分子的长程有序结构(即晶体), 虽然可用于淀粉粒晶体类型的定性分析, 但在定量计算淀粉等多晶体系的结晶度方面存在一定的困难[2]。13C CP/MAS NMR测定淀粉分子的短程有序, 能够研究淀粉粒的晶体类型和计算淀粉的结晶度和双螺旋含量, 但仪器较昂贵, 测试样品用时较长, 结晶度和双螺旋含量定量计算也非常复杂[4]。FTIR对淀粉结晶、分子链的构象及螺旋结构的改变十分敏感, 用于淀粉粒短程有序结构的研究[5]。与XRD和13C CP/MAS NMR相比, FTIR测试所需样品量极少(10 mg)、操作快速简单(2~3 min)、灵敏度高, 在国外已广泛用于淀粉粒有序结构的分析[5-7], 但在国内这方面的报道较少。
FTIR分析淀粉粒结构时需要对原始波谱进行去卷积, 其设置条件包括半峰宽和增强因子。半峰宽设置从15 cm-1到26 cm-1, 增强因子设置从1.5到2.6都有文献报道[5-8], 如Chung等[6]将半峰宽设为15 cm-1, 增强因子设为1.5; Sevenou等[5]将半峰宽设为19 cm-1, 增强因子设为1.9; Rubens等[7]将半峰宽设为21 cm-1, 增强因子设为1.7; Li等[8]将半峰宽设为26 cm-1, 增强因子设为2.4。不同的设置条件, 对研究结果影响很大, 导致不同的文献结果没有可比性, 但设置条件对研究结果到底有什么影响目前还未见
文献报道。FTIR分析淀粉粒有序结构有2种模式: 衰减全反射模式(attenuated total reflectance, ATR)和透射模式(transmittance), 前者分析淀粉粒表层 2 µm厚的结构信息, 而后者分析的是整个淀粉粒的结构信息[5]。FTIR衰减全反射和透射模式的原理和制样方法完全不同, 但对研究结果有什么影响目前也未见报道。FTIR波谱的(1045/1022) cm-1和(1022/ 995) cm-1峰强度比值被看作是淀粉粒有序结构的指标, 其中(1045/1022) cm-1峰强度比值反映淀粉分子的有序程度, 其比值越大, 有序度越高[5]。
本研究选用A-型晶体水稻淀粉、B-型晶体马铃薯淀粉和C-型晶体山药和豌豆淀粉为试验材料, 探讨不同去卷积设置条件对淀粉FTIR分析结果的影响, 并分析了FTIR在淀粉粒有序结构分析中的应用, 研究结果可为应用FTIR技术分析淀粉粒有序结构提供重要的参考作用。
1材料与方法
1.1试验材料
水稻(Oryza sativa L.)品种特青(Teqing)、南京11 (Nanjing 11)、武运粳8号(Wuyujing 8)、中花11 (Zhonghua 11)、黄华占(Huanghuazhan)、桂花黄(Gui-huahuang)、南特号(Nantehao)和桂朝2号(Guichao 2)成熟种子采收于扬州大学试验田, 马铃薯(Solanum tuberosum L.)块茎、山药(Dioscorea opposita Thunb)根状茎和豌豆(Pisum sativum L.)种子采购于扬州市农贸市场。
1.2天然淀粉粒的分离
水稻精米和豌豆种子用ddH2O浸泡过夜, 马铃薯块茎和山药根状茎去皮切成薄片。以研钵充分研磨, 加ddH2O搅拌, 用4层纱布过滤, 然后将滤液分别过100、200、300和400目筛, 将滤液3 000×g离心10 min, 获得沉淀。用ddH2O悬浮沉淀, 再离心。反复几次, 直到上清液澄清为止。沉淀经无水乙醇脱水2次, 40℃干燥2 d, 研磨成粉末, 过100目筛, -20℃保存备用。
1.3酶解淀粉的制备
参考Li等方法[9], 利用淀粉葡糖苷酶(amylog-lucosidase, AMG)水解水稻特青淀粉。200 mg淀粉悬浮于40 mL酶液(0.05 mol L-1醋酸钠缓冲液, pH 4.5,
第3期满建民等: 红外光谱技术在淀粉粒有序结构分析中的应用507
100 U AMG), 其中AMG来源于黑曲霉(Aspergillus niger)(Sigma-Aldrich产品)。淀粉酶液在恒温振荡水浴中, 100 r min-1、55℃条件下进行酶解反应。酶解结束后, 3 000×g离心10 min, 获得沉淀。用ddH2O 悬浮沉淀, 再离心。重复2次, 沉淀经无水乙醇脱水2次, 40℃干燥2 d, 研磨成粉末, 过100目筛, -20℃保存备用。
1.4酸解淀粉的制备
参考Wei等[10]方法制备酸解淀粉。2 g豌豆淀粉加100 mL 2.2 mol L-1的HCl溶液, 于35℃酸水解, 期间
每天早晚摇匀淀粉沉淀2次。淀粉盐酸溶液经3 000×g离心10 min, 用ddH2O悬浮沉淀, 再离心。重复3次, 最后用无水乙醇脱水2次, 40℃干燥2 d, 研磨成粉末, 过100目筛, –20℃保存备用。
1.5直链淀粉含量测定
参考Konik-Rose等[11]方法并略有改进, 测定分离淀粉粒的直链淀粉含量。将10 mg淀粉悬浮在5 mL尿素–二甲基亚砜溶液(UDMSO)(9份DMSO和1份6 mol L-1尿素)中, 在95℃水浴中溶解1 h, 期间间歇摇匀。1 mL淀粉UDMSO溶液和1 mL 0.2% I2、2% KI (W/V)染液用ddH2O定容到50 mL。在分光光度计上测定620 nm波长下的吸光度。用马铃薯直链淀粉和玉米支链淀粉按不同比例混合配制的标准溶液制备标准曲线, 计算直链淀粉含量。每一样品做3次重复。
1.6透射FTIR光谱的采集
淀粉经105℃干燥2 h, 采用KBr压片法, 按照1%的比例与KBr充分混合、研磨、压片, 于红外光谱仪(Varian 7000)上测试。扫描波数范围为 4 000~ 800 cm-1, 分辨率为4 cm-1, 采用DTGS检测器, 以不含淀粉样品的KBr压片为空白扫背景, 扫描累加64次, 得到样品的红外光谱图。
1.7 ATR-FTIR光谱的采集
将含有一定水分的淀粉, 加到OMNI采样器中, 利用ATR支架, 对淀粉样品进行全反射光谱扫描, 扫描设
置同1.6, 以水为空白扫背景。
1.8 FTIR波谱分析
利用FTIR附带的软件分析波谱。首先选取波数为1 200~800 cm-1区域的谱图, 调整基线, 设置半峰宽和增强因子, 对选取的波谱进行去卷积, 获得去卷积波谱。利用Origin 6.0对波谱作图, 测定1045、1022和995 cm-1各峰顶点到基线的高度(即峰强度), 计算(1045/1022) cm-1和(1022/995) cm-1的峰强度比值。2结果与分析
2.1淀粉FTIR波谱去卷积设置分析
水稻品种特青含水量70%淀粉的ATR-FTIR和干燥淀粉的透射FTIR原始波谱见图1-a。参考相关文献[5-8], 将半峰宽分别设置为15、19、23和27 cm-1, 增强因子分别设置为1.5、1.9、2.3和2.7, 对原始波谱进行去卷积, 结果见图1-b~e。半峰宽和增强因子不同, 对图谱各峰影响较大。(1045/1022) cm-1和(1022/995) cm-1峰强度比值被看作是淀粉有序结构的指标, 其中(1045/1022) cm-1峰强度比值表示淀粉分子结构中的有序结构和无定形结构的比例关系, 其比值越大, 颗粒内有序度越高[5,12-13]。从图1可以看出, 半峰宽为23 cm-1和27 cm-1, 增强因子为1.5时, 不能将1 022 cm-1和995 cm-1附近的峰分开; 而增强因子为2.7时, 会有许多背景峰出现。不同半峰宽和增强因子设置条件下, ATR-FTIR和透射FTIR 去卷积波谱的(1045/1022) cm-1和(1022/995) cm-1峰强度比值见表1, 不同半峰宽和增强因子对(
1045/ 1022) cm-1和(1022/995) cm-1峰强度比值影响较大。综合分析, 选择半峰宽为19 cm-1, 增强因子为 1.9时, 对FTIR原始波谱去卷积效果较好。比较透射FTIR波谱和ATR-FTIR波谱的原始波谱和去卷积波谱, 以及(1045/1022) cm-1和(1022/995) cm-1峰强度的比值, 可以看出, 透射模式和ATR模式对淀粉的分析结果相差较大。
2.2不同晶体类型FTIR波谱分析
水稻、马铃薯和山药淀粉分别代表A-型、B-型和C-型晶体淀粉, 含水量70%淀粉的ATR-FTIR原始波谱见图2-A, 干燥淀粉的透射FTIR原始波谱见图2-B。不同晶体类型之间原始波谱的主要区别发生在1 050~950 cm-1, ATR-FTIR与透射FTIR原始波谱之间差别较大。对原始波谱进行去卷积, 半峰宽设为19 cm-1和增强因子设为1.9, 去卷积的ATR- FTIR波谱和透射FTIR波谱分别见图2-C和2-D, (1045/1022) cm-1和(1022/995) cm-1峰强度的比值见表2。在ATR-FTIR波谱中, 水稻淀粉的去卷积波谱明显不同于马铃薯和山药, 水稻淀粉(1045/1022) cm-1峰强度比值明显比马铃薯和山药低, (1022/995) cm-1峰强度比值明显比马铃薯和山药高, 而马铃薯和山药淀粉的(1045/1022) cm-1和(1022/995) cm-1峰强度比值相似。在透射FTIR波谱中, 山药淀粉(1045/1022) cm-1峰强度比值比水稻和马铃薯高, (1022/995) cm-1峰强度比值明显比水稻和马铃薯低,
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作 物 学 报 第38卷
而水稻和马铃薯淀粉的(1045/1022) cm -1和(1022/995) cm -1峰强度比值相似。ATR-FTIR 和透射FTIR 波谱间的比较表明, 透射模式下(1022/995) cm -1峰强度比值明显比ATR 模式下高, 水稻和山药淀粉(1045/
1022) cm -1峰强度比值相似, 而马铃薯淀粉(1045/ 1022) cm -1峰强度比值在透射模式下比ATR 模式下低。上述结果表明, 淀粉晶体类型不同, ATR-FTIR 和透射FTIR 波谱表现也不同。
图1 水稻淀粉FTIR 原始波谱和去卷积波谱
Fig. 1 Original and deconvoluted FTIR spectra of rice starches
a: 原始波谱; b~e: 去卷积波谱, 半峰宽分别为15 (b)、19 (c)、23 (d)和27 cm -1 (e), 其中每个半峰宽的增强因子从下至上分别为
1.5、1.9、
2.3和2.7。
a: Original spectrum; b–e: Deconvoluted spectra, the peak half-width of wavenumber was 15 (b), 19 (c), 23 (d), and 27 cm -1 (e), respectively. The resolution enhancement factor of the deconvoluted spectrum is 1.5, 1.9, 2.3, and 2.7 from the bottom to the top in each peak half-width of
wavenumber.
表1 水稻淀粉FTIR 去卷积波谱的(1045/1022) cm -1和(1022/995) cm -1峰强度比值比较
Table 1 IR ratio of the absorbances (1045/1022) cm -1 and (1022/995) cm -1 for deconvoluted FTIR spectra of rice starches 衰减全反射FTIR ATR-FTIR 透射FTIR Transmittance-FTIR
半峰宽
Peak half-width of wavenumber (cm -1)
增强因子
Resolution enhancement
factor
(1045/1022) cm -1
(1022/995) cm -1 (1045/1022) cm -1 (1022/995) cm -1
1.5 0.54 1.24 0.63 1.54
1.9 0.57 1.23 0.62 1.55
2.3 0.57 1.22 0.61 1.51 15
物理老师演示电流2.7 0.58 1.20 0.62 1.50
1.5 0.55 1.25 0.65 1.56
1.9 0.57 1.28 0.59 1.59
2.3 0.61 1.25 0.56 1.57 19
2.7 0.59 1.23 0.55 1.55
1.5 0.55 1.29 0.67 1.58
1.9 0.59 1.33 0.65 1.61
2.3 0.60 1.31 0.51 1.58 23
2.7 0.67 1.26 0.52 1.55
1.5 nd a nd a
0.64 1.64
1.9 0.65 1.37 0.71 1.65
2.3 0.61 1.40 0.66 1.64 27
2.7 0.64 1.34 0.45 1.59
a
nd: 未检测。a nd: not detected.
第3期满建民等: 红外光谱技术在淀粉粒有序结构分析中的应用509
图2不同晶体类型淀粉FTIR原始波谱和去卷积波谱
Fig. 2 Original and deconvoluted FTIR spectra of starches with different crystalline types
A: ATR-FTIR原始波谱; B: 透射FTIR原始波谱; C: 去卷积ATR-FTIR波谱; D: 去卷积透射FTIR波谱; a: 水稻; b: 马铃薯; c: 山药。
A, B: original spectra; C, D: deconvoluted spectra; A, C: ATR-FTIR; B, D: transmittance-FTIR; a: rice; b: potato; c: Chinese yam.
表2不同晶体类型淀粉FTIR去卷积波谱的(1045/1022) cm-1和(1022/995) cm-1峰强度比值比较
Table 2 IR ratio of the absorbances (1045/1022) cm-1 and (1022/995) cm-1 for deconvoluted FTIR spectra of starches with different
袖阀管
crystalline types
衰减全反射FTIR ATR-FTIR 透射FTIR Transmittance-FTIR 试验材料
Plant material (1045/1022) cm-1 (1022/995)
cm-1 (1045/1022)
cm-1 (1022/995)
南山丽景度假酒店事件cm-1水稻 Rice 0.57 1.28 0.59 1.59 马铃薯 Potato 0.75 0.94 0.60 1.54 山药 Chinese yam 0.71 0.97 0.71 1.28
2.3含水量对淀粉ATR-FTIR波谱影响分析全密封变压器
应用ATR-FTIR分析天然淀粉的有序结构, 样品含水量对分析结果会产生影响。对不同含水量水稻特青淀粉进行ATR-FTIR分析, 将半峰宽设为19 cm-1和增强因子设为1.9, 去卷积的ATR-FTIR波谱见图3, (1045/1022) cm-1和(1022/995) cm-1峰强度比值见表3。从图谱中可以看出, 水分含量对波谱各峰强度有影响。样品含水量超过60%时, 对波谱基本没有影响。因此, 对淀粉进行ATR-FTIR波谱分析时, 样品含水量应控制在60%以上, 以便于样品间的比较, 排除水分的干扰。
2.4酸解淀粉ATR-FTIR波谱分析
豌豆淀粉经盐酸水解, 对不同水解天数含水量70%淀粉的ATR-FTIR原始波谱进行去卷积, 半峰宽设为19 cm-1和增强因子设为1.9的去卷积波谱见图4, (1045/1022) cm-1和(1022/995) cm-1峰强度比值见表4。从图谱和峰强度比值可以看出, 伴随酸解, 1022 cm-1峰强度逐渐降低, (1045/1022) cm-1峰强度比
值逐渐升高, 而(1022/995) cm-1峰强度比值逐渐降低, 表明酸水解淀粉无定形结构成分比有序结构成分快, 导致淀粉有序度提高。
2.5酶解淀粉FTIR波谱分析
利用AMG对水稻特青淀粉进行酶水解, 对酶解含水量70%淀粉的ATR-FTIR和干燥淀粉的透射FTIR原始波谱进行去卷积, 半峰宽设为19 cm-1和增强因子设为1.9的去卷积波谱见图5, (1045/1022) cm-1和(1022/995) cm-1峰强度比值见表5。从图谱和峰强度比值可以看出, ATR-FTIR和透射FTIR分析结果完全不同。伴随酶解, ATR-FTIR获得的(1045/ 1022) cm-1峰强度比值变化不大, 透射FTIR获得的(1045/1022) cm-1峰强度比值显著增加, 表明AMG 水解淀粉对淀粉外部区域的有序度影响不大, 但明显提高整个淀粉的有序度。
2.6不同直链淀粉含量稻米淀粉ATR-FTIR波谱分析
直链淀粉含量是淀粉理化特性最重要的指标, 决定淀粉的品质和用途。对含水量70%的不同直链淀粉含量的稻米淀粉进行ATR-FTIR分析, 半峰宽
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