热带亚热带植物学报2021, 29(3): 293 ~ 300
Journal of Tropical and Subtropical Botany
王丽丽, 林清霞, 宋振硕, 陈林*
(福建省农业科学院茶叶研究所, 福州350013)
摘要：为了解白茶对弹性蛋白酶活性的作用，测定了6个白茶样品对猪胰弹性蛋白酶(PPE)活性的抑制作用。结果表明，6个白茶样品中CB4对PPE抑制活性最强，为69.73%；且随体积分数增加，酶抑制活性增强，呈剂量依赖性抑制。白茶水提液的4个萃取层中乙酸乙酯层(WEA)的抑制活性最强，达到82.58%。CB4的多酚总量(TPs)较高，且表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)、表儿茶素没食子酸酯(ECG)和(CAF)含量最高。WEA萃取层中TPs、EGCG、ECG和ECG含量均最高，CAF含量极低。PPE活性抑制率与TPs、EGCG和CAF含量呈极显著正相关，相关系数均大于0.90。0.1~1.0 mg/mL EGCG 和0.05~2.0 mg/mL CAF对PPE无抑制活性，0.05~2.0 mg/mL 没食子酸(GA)对PPE活性具有促进作用，且GA的促进作用与其浓度呈正相关。可见，白茶具有潜在抗衰老活性，但对PPE起抑制作用的活性成分不是EGCG、GA和CAF。 服务质量分析
三维地图关键词：白茶；乙酸乙酯萃取层；猪胰弹性蛋白酶；抑制活性
doi: 10.11926/jtsb.4282
Studies on Anti-elastase Activity of White Tea
WANG Li-li, LIN Qing-xia, SONG Zhen-shuo, CHEN Lin*
(Tea Research Institution, Fujian Academy of Agricultural Sciences, Fuzhou 350013, China)
Abstract: In order to understand the anti-elastase effect of white tea, the inhibitory effect of aqueous extract from six white tea samples (CB1-CB6) on porcine pancreatic elastase (PPE) were measured. The results showed that CB4 had the strongest inhibition on PPE among six white tea samples with inhibition rate of 69.73%. In addition, elastase inhibition activity of CB4 increased with the concentration, showing a dose-dependent manner. Among the four extraction layers, ethyl acetate (WEA) layer had the strongest inhibitory activity, reaching 82.58%. The total polyphenol (TPs) content in CB4 was high, and the contents of epigallocatechin gallate (EGCG), epicatechin gallate (ECG), and caffeine (CAF) were the highest among six samples. Among 4 extraction layers, the contents of EGCG, ECG, ECG, and total polyphenols in WEA layer were the highest and that of CAF
was very low. There were significant positive correlation between elastase inhibition rate and the contents of TPs, EGCG and CAF with correlation coefficient above 0.90. However, neither 0.1-1.0 mg/mL EGCG nor 0.05-2.0 mg/mL CAF had inhibitory effects on PPE activity. Conversely, 0.05-2.0 mg/mL GA showed a promotion effect on PPE activity, and the promoting effect of GA was positively correlated with its concentration. Therefore, it was suggested that white tea exhibited potentially anti-aging activity, but the active ingredients that inhibited PPE were not EGCG, GA and CAF.
Key words: White tea; Ethyl acetate extraction layer; Porcine pancreatic elastase; Inhibitory activity
收稿日期: 2020–07–2 接受日期: 2020–11–18
基金项目：福建省属公益类科研院所专项(2020R1029006, 2019R1029-3); 福建省自然科学基金项目(2020J011367)资助
This work was supported by the Special Project for Public Welfare Research Institutes in Fujian (Grant No. 2020R1029006, 2019R1029-3), and the Natural Science Foundation in Fujian (Grant No. 2020J011367).
第一作者简介：王丽丽(1985~ )，女，助理研究员，从事茶叶生物化学及天然产物分析研究。E-mail:****************
* 通信作者Correspondingauthor.E-mail:******************
294 热带亚热带植物学报第29卷
弹性蛋白酶具有降解胶原蛋白、弹性蛋白等多种蛋白质的能力。皮肤组织中的弹性蛋白被弹性蛋白酶降解与皮肤衰老发生过程密切相关，因此对抗弹性蛋白酶对弹性蛋白的降解，恢复皮肤弹性是延缓皮肤衰老的重要途径之一[1]。研究表明，很多植物提取物如芦丁、黄芩素、高良姜素(又名3,5,7-三羟基黄酮)、虎杖苷等是天然弹性蛋白酶抑制剂[2–5]。白茶是我国六大茶类之一，富含多酚类物质，具有清凉、退热、降火、祛暑等功效。近年来，随着人们对健康的追求日益高涨，白茶逐渐步入大众视野，其独特的风味品质和保健功效引起了国内外消费者的关注和喜爱。有研究表明，白茶水提取物对弹性蛋白酶的抑制率高达89%[6]，且当其作用于体外培养的人皮肤成纤维细胞时，可有效缓解H2O2诱导造成的细胞凋亡损伤[7], 但对于白茶提取物中可能起作用的有效成分尚未见报道。本研究测定了6个白茶样品水提液及其不同萃取层对猪胰弹性蛋白酶(PPE, porcine pancreatic elastase)的抑制活性，并分析其化学组成，同时测定了没食子酸(GA, gallic acid)、表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG, epigallocatechin gallate)和(CAF, caffeine)的酶活抑制率，推测可能起作用的有效成分，以期为白茶延缓皮肤衰老研究提供理论依据, 为其在女性抗皮肤衰老化妆品领域的应用提供数据支撑。
1 材料和方法
1.1 试剂和材料
刚果红-弹性蛋白(德国Ruibio)与PPE (德国Ruibio, 活性≥30 U/mg)购自合肥博美生物科技有限责任公司；0.2 mol/L硼酸盐缓冲液(pH 8.8);
0.5 mol/L磷酸盐缓冲液(pH 6.0)；GA (上海生工生物, 纯度>98%)、EGCG与CAF (上海阿拉丁，纯度>99%)标准品；白茶样品6份(表1)，市售，系白牡丹等级，分别记作CB1~CB6。
银行卡收单业务管理办法
1.2 仪器
SKY-200B摇床(上海苏坤)、V ARIOSKAN LUX 多功能酶标仪(美国Thermo scientific)、ACD-0502-U 超纯水机(重庆艾科浦)、PB-10酸度计(德国Sarto- rius)、MS 3 basic旋涡混匀器(德国IKA)、5418R小型台式离心机(德国Eppendorf)、CVE-3000型离心浓缩仪(日本EYELA)。
表1 茶样信息
Table 1 Information of white tea samples
1.3 白茶水提液及其萃取层制备
称取白茶样品4 g，加100 mL沸水，沸水浴提取15 min，滤纸抽滤制得白茶水提液，当日使用。参照杨子银等[8]的方法制备CB4萃取层，依次得到氯仿层(WEC)、乙酸乙酯层(WEA)、正丁醇层(WEB)和剩余水层(WER)。各萃取层浓缩至干(呈浸膏状)，–20℃冷冻保存备用。
1.4 对PPE抑制率的测定
参照姚亚红等[3]的方法，稍作修改。准确称取20 mg刚果红-弹性蛋白至50 mL离心管内，加入5 mL 37℃预热的0.2 mol/L硼酸盐缓冲液(pH 8.8)，充分涡旋混匀，水浴20 min，加入2 mL经37℃预热的用硼酸盐缓冲液配制的PPE溶液(浓度为0.5、1、2、4、6 mg/mL)，充分涡旋混匀，在37℃、400 r/min摇床振荡20 min，立即加入pH 6.0的0.5 mol/L磷酸盐缓冲液5 mL，涡旋混匀，取混匀液适量至2 mL离心管内, 在9 391×g下离心10 min，精密吸取上清液200 L 至96孔板内，在波长495 nm处测定吸光度。以PPE 浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。
取2 mg/mL PPE溶液2 mL，加入酶抑制剂(CB1~ CB6水提液或CB4各萃取层) 2 mL，充分涡旋混匀，在37℃、400 r/min摇床振荡20 min，立即加入pH 6.0的0.5 mol/L磷酸盐缓冲液5 mL，涡旋混匀，取
第3期王丽丽等: 白茶对弹性蛋白酶活性的抑制研究295
混匀液适量至2 mL离心管内，在9 391×g下离心10 min，精密吸取上清液200 L至96孔板内，在波长495 nm处测定吸光度，同时进行400~800 nm 光谱扫描。以底物加酶溶液为空白对照组，底物加酶和茶溶液为酶抑制组，底物加茶不加酶溶液作扣茶汤背景用。每组均设2复孔。抑制率(%)=[1–(A n–A n′)/(A0–A0′)]×100%, 式中, A0为加酶不加茶的吸光度，A0′为仅加底物不加茶和酶的吸光度，A n 为仅加茶溶液的吸光度，A n′为加茶不加酶的吸光度。若A n′>A n，则表现为促进作用，促进率(%)=[1–(A n′–A n)/(A0–A0′)]×100%。
1.5 白茶水提液与萃取层的组分分析代雨映
多酚(TPs, tea polyphenols)总量测定采用福林酚比法[9]；黄酮类(Fs, flavones)总量测定采用三氯化铝比法[10]；GA、儿茶素组分[没食子儿茶素(GC, gallocatechin)、表没食子儿茶素(EGC, epigallocate- chin)、表儿茶素(EC, epicatechin)、没食子儿茶素没食子酸酯(GCG, gallocatechin gallate)、EGCG、表儿茶素没食子酸酯(ECG, epicatechin gallate)]和生物碱[可可碱(TB, theobromine)、CAF]含量测定采用HPLC 法[11]。
1.6 GA、EGCG、CAF标准品对PPE活性作用
用超纯水配制GA、EGCG、CAF标准品母液, 分装，–70℃保存，现取现用，忌反复冻融。用硼酸盐缓冲液稀释成浓度分别为0.1、0.25、0.5、1.0、2.0 mg/mL EGCG，0.05、0.25、0.5、1.0、2.0 mg/
mL GA和CAF溶液，用于测定酶抑制率或促进率(%)。
1.7 数据的统计分析
所有数据以平均值±标准差(n=3)表示。采用origin 2018对数据进行处理和作图。采用SPSS 21.0软件进行单因素方差分析(One-Way ANOV A)，显著性差异分析采用SNK法，显著水平为0.01；双变量分析酶活抑制率与组分含量的相关性，显著性采用双侧t-检验，相关系数采用Pearson相关性分析。
2 结果和分析
2.1 白茶对PPE的抑制活性
PPE标准曲线制作以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线，得到方程y=0.2212x+ 0.4357，R2=0.993 5。结果表明，PPE在1~ 6 mg/mL 范围内，PPE对底物(弹性蛋白)的水解活性呈现良好的线性关系，相关系数达到0.993 5 (图1)。
图1 PPE对弹性蛋白的水解作用
Fig. 1 Hydrolysis of elastin by PPE
白茶水提液从图2可见，白茶水提液用硼酸盐缓冲液稀释成体积分数75%后，CB4对PPE 活性的抑制率最大，达69.73%，CB1的抑制效果最差；CB2~CB6抑制PPE的水解活性与CB1的差异达极显著水平(P<0.01)。从图3可见，CB4水提液用硼酸盐缓冲液稀释成体积分数100%、75%、67%、50%、33%和25%，不同体积分数的CB4对PPE活性呈剂量依赖性抑制，且随体积分数降低，抑制率逐渐下
降；体积分数为25%~75%的CB4对PPE的抑制活性与100%的差异达极显著水平(P<0.01)。
图2 白茶水提液对PPE的抑制活性。柱上不同字母表示差异极显著(P< 0.01)。下图同。
Fig. 2 Inhibition effect of white tea aqueous on elastase activity. Different letters upon column indicate significant differences at 0.01 level. The same is following Figures.
400~800 nm光谱扫描结果表明(图4)，PPE水解底物在495 nm波长附近出现最大吸收峰，底物+酶+CB4以及底物+CB4混合溶液亦是如此，因此选择495 nm测定酶活，但底物+CB4混合溶液有
296 热带亚热带植物学报第29卷
背景干扰，需要扣除其OD值。底物、酶、CB4以及酶+CB4的混合溶液在495 nm处的OD值很低，可忽略不计。
图3 不同体积分数CB4水提液对PPE的抑制活性
Fig. 3 Inhibition effect of CB4 with different volume fractions on elastase activity
图4 PPE水解底物的光谱扫描图
Fig. 4 Spectral scan of PPE hydrolyzed substrate
CB4萃取层CB4水提液的WEC、WEA、WEB、WER萃取层用0.5 mL超纯水溶解，再用硼酸盐缓冲液稀释10倍后进行测定，从图5可见, WEA 的抑制率最高，达到82.58%，且与其他萃取层的差异达极显著水平。
2.2 白茶水提液及其萃取层的组分
白茶水提液CB6水提液中的多酚(TPs)总量最高，其次是CB4，但两者相近(表2)。同时, CB6的黄酮总量最高，其次是CB1。从表3可见，CB4水提液中表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)、表儿茶素没食子酸酯(ECG)、儿茶素总量(TC)、(CAF)和生物碱总量(TA)含量均最高，其次是CB5与CB6 (表3)。CB6水提液中没食子酸(GA)含量最高。
图5 CB4不同萃取层对PPE的抑制活性。WEC: 萃取层; WEA: 乙酸乙酯萃取层; WEB: 正丁醇萃取层; WER: 剩余水层。图6和表4同。Fig. 5 Inhibition effect of different extraction layers of CB4 on elastase activity. WEC: Chloroform extraction layer; WEA: Ethyl acetate extraction layer; WEB: n-butyl alcohol extraction layer; WER: Residual water extraction layer. The same is Fig. 6 and Table 4.
表2 白茶水提液中多酚与黄酮总量
Table 2 Contents of polyphenols and flavones in white tea aqueous 编号
Code
多酚Polyphenols
(TPs, %)
黄酮Flavones
(Fs, mg/g) CB1 7.87±0.017 3.96±0.046
CB2 9.15±0.071 3.55±0.016
CB3 8.28±0.044 3.73±0.016
CB4 9.70±0.053 3.61±0.059
CB5 9.50±0.027 3.02±0.048
CB6 9.79±0.018 5.77±0.035
CB4萃取层分别取WEC、WEA、WEB、WER母液用超纯水稀释10、500、100和100倍后，测定多酚含量，为使各萃取层中多酚含量具可比性，统一折算成酶活作用浓度(10倍稀释液)。WEA、WEB、WER、WEC中的多酚含量分别为3 000、1 100、667和13 μg/mL。可见WEA中的多酚含量最高, WEC最低，两者相差200倍以上(图6)。各萃取层10倍稀释液中没食子酸、儿茶素与生物碱组分含量见表4，WEC主要含有CAF，约为1 243 μg/mL，儿茶素含量极低，总量仅4.57 μg/mL；WEA中以儿茶素类为主，包括EGCG、ECG、ECG和GCG等，总量达3 000 μg/mL以上，CAF含量仅93 μg/mL; WEB中仍含有儿茶素，而WER中含量较少，二者均含有少量的生物碱；且GA含量以WER最高。这表明WEA中多酚和儿茶素类含量最高，而WEC 主要含有CAF。
第3期王丽丽等: 白茶对弹性蛋白酶活性的抑制研究297
表3 白茶水提液中没食子酸、儿茶素与生物碱组分含量(mg/g)
Table 3 Contents of gallic acid, catechins and alkloids of white tea aqueous
组分Component CB1 CB2 CB3 CB4 CB5 CB6
没食子酸Gallic acid (GA) 2.77±0.02 3.59±0.01 3.41±0.00 3.64±0.00 4.37±0.03 4.82±0.03
儿茶素Catechin 没食子儿茶素Gallocatechin (GC) 4.37±0.51 3.87±0.02 3.31±0.03 2.59±0.10 2.64±0.01 2.11±0.04 表没食子儿茶素Epigallocatechin (EGC) 7.18±0.00 5.49±0.02 5.46±0.01 3.92±0.01 6.00±0.11 4.94±0.17 表儿茶素Epicatechin (EC) 4.03±0.02 3.13±0.00 3.63±0.01 0.99±0.01 0.80±0.01 1.97±0.14 没食子儿茶素没食子酸酯Gallocatechin gallate (GCG) 2.64±0.00 2.46±0.05 1.87±0.00 2.94±0.00 2.19±0.00 2.21±0.03 表没食子儿茶素没食子酸酯Epigallocatechin gallate
(EGCG)
20.44±0.01 26.25±0.05 23.50±0.05 39.88±0.01 34.07±0.24 32.43±0.20 表儿茶素没食子酸酯Epicatechin gallate (ECG) 7.01±0.00 9.20±0.01 8.15±0.01 9.31±0.03 9.06±0.06 8.97±0.07
散血莲儿茶素总和Total catechin (TC) 46.68±0.53 51.21±0.05 46.66±0.07 60.26±0.10 55.30±0.41 53.34±0.35
生物碱Alkaloid 可可碱Theobromine (TB) 1.28±0.00 0.59±0.00 1.12±0.01 0.87±0.00 1.90±0.02 0.41±0.01 Caffeine (CAF) 25.93±0.07 28.92±0.00 28.45±0.00 36.14±0.01 32.72±0.24 35.21±0.03
生物碱总和Total alkaloid (TA) 27.20±0.07 29.51±0.01 29.58±0.04 37.00±0.01 34.62±0.26 35.62±0.04
2.3 相关性分析
相关性分析表明，PPE活性抑制率与白茶的TPs、EGCG、TC、CAF含量的相关系数分别为0.94、0.97、0.04和0.98，均呈极显著正相关(P<0.01); 而与EC、GC含量的相关系数为负值，分别为-0.93和-0.88，呈显著负相关；与Fs和GA相关系数分别为0.73和0.21，但不具有显著性。
2.4 EGCG、GA、CAF标准品对PPE活性的抑制
作用
TPs和CAF是茶叶的特征性物质，而儿茶素是TPs的主体成分，其中EGCG约占总量的70%~ 80%[12]。GA是TPs含量测定中常用的标准物质。由表3和表4换算可知，测定酶活抑制率所用的白茶水提液与CB4不同萃取层中约含有0~2.0 mg/mL EGCG、0~0.15 mg/mL GA和0.05~1.5 mg/mL CAF。分
别用0.1~2.0 mg/mL EGCG、0.05~2.0 mg/mL GA 和0.05~2.0 mg/mL CAF标准品对PPE活性的抑制
图6 不同萃取层中的多酚含量
Fig. 6 Content of polyphenols in different extraction layers
表4 不同萃取层中没食子酸、儿茶素和生物碱含量( g/mL)
Table 4 Contents of GA, catechins and alkaloids in different extraction layers
生死跳伞组分Component WEC WEA WEB WER GA 0.46±0.00 46.53±0.35 49.29±0.38 116.16±0.10 GC ND ND 52.65±0.49 65.06±8.89 EC 3.20±0.16 49.16±0.85 5.05±0.43 28.69±2.59 EGC ND 339.64±12.93 99.34±3.06 ND
GCG ND 261.85±0.69 38.24±0.34 ND
EGCG ND 1 881.91±5.04 290.24±2.90 23.23±2.45 ECG 1.37±0.00 507.30±3.58 52.61±0.52 ND
TC 4.57±0.16 3 087.35±25.05 590.36±7.90 116.98±13.94 TB 8.35±0.03 ND 15.32±0.23 20.19±0.05 CAF 1 242.74±0.67 93.04±0.28 93.65±0.96 62.53±1.55 TA 1 251.10±0.71 93.23±0.28 117.17±1.20 85.83±1.75 ND: 未检测到。GA、GC、EC、EGC、GCG、EGCG、ECG、TC、TB、CAF、TA见表3。下表同。
ND: Not detected. GA, GC, EC, EGC, GCG, EGCG, ECG, TC, TB, CAF and TA see Table 3. The same is following Table.
豫公网安备41160202000603
站长QQ:729038198
关于我们
投诉建议