佛光大辞典蛋白免疫印迹(Western Blot)技术指南 一、蛋白免疫印迹(Western Blot)技术概览
蛋白免疫印迹(Western Blot，以下简称WB)是利用特定抗体能够专一结合其抗原“蛋白质”的原理来对样品进行着，通过分析着的位置和着深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中的表达或修饰水平的免疫检测技术。 一般我们使用WB都是为了半定量检测某种目的蛋白的相对表达量，通常要以表达相对稳定的蛋白作为内部对照（内参），然后采用“灰度分析软件”检测目的蛋白及内参条带的表达强度，每组目的蛋白分别以内参作为对照进行比对和相对定量，以使实验结果更加准确。同时，同一批样品至少进行技术重复三次，然后方可进行统计学分析。WB灵敏度可达ng级，用ECL显法理论上可达pg级。
二、蛋白免疫印迹(WB)实验所需仪器、材料及试剂
（一）主要实验仪器
制冰机、超声破碎仪、低温冷冻离心机、蛋白电泳/转膜仪、多功能酶标仪、LI-COR Odyssey成像系统 （二）主要实验试剂与材料
15ml离心管、玻璃组织研磨器、EP管、冰浴、蛋白抽提试剂(改进型RIPA配方，Bioss 产品货号C05-01001)、蛋白酶抑制剂混合物(protease inhibitor cocktail)、BCA蛋白定量试剂盒(Bioss产品货号C05-02001)、30%丙烯酰胺-N,N-亚甲基双丙烯酰胺混合液(29:1)(Bioss产品货号C05-03004)、10%过硫酸铵(APS)(Bioss产品货号C05-03009)、四甲基乙二胺(TEMED)(Bioss产品货号C05-03008)、4×蛋白上样缓冲液(Bioss产品货号C05-03015)、蛋白Marker(Bioss产品货号C05-090006)、电
泳缓冲液(Bioss产品货号C05-03010)、转膜缓冲液(Bioss产品货号C05-05003)、考马斯亮蓝染液(Bioss产品货号C05-04001)、TBST缓冲液(pH7.4)(Bioss产品货号C5049)、PVDF膜(Bioss产品货号C55008)或NC膜(0.22µm)(Bioss产品货号C05-05002)、丽春红染液(Bioss产品货号C05-04002)、脱脂奶粉(Bioss产品货号C5059)、牛血清白蛋白(BSA)、目的蛋白一抗、WB一抗稀释液(Bioss产品货号C05-07001)、HRP标记二抗(bs-0295G-HRP或bs-0296G-HRP)或荧光标记二抗(Bioss内部操作流程选用荧光二抗，Bioss产品货号bs-40295G-IRDye8或bs-40296G-IRDye8)、WB二抗稀释液(Bioss产品货号C05-07002)、ECL发光液(Bioss产品货号C05-07004)、膜再生液(Bioss产品货号C05-03041)
Western Blot操作流程图
三、蛋白免疫印迹(WB)实验标准操作流程和技术要点
（一）蛋白提取
●组织样品蛋白提取方法
1.用灭菌（预冷）的工具分离新鲜目的组织50mg-100mg，并用生理盐水或PBS
洗涤干净，用洁净的剪刀将组织剪碎至合适大小。
2.将剪碎的组织转移到玻璃研磨器中，加入适量的含有蛋白酶抑制剂（必要时还
需要加入磷酸酶抑制剂）的RIPA（按照每20mg组织加入150-250µl裂解液的比例加入裂解液），置于冰上研磨2-5min，直到看不到明显的大的细胞团块，然后在冰浴裂解30min，让组织细胞充分裂解；可取少量裂解后组织液滴于载玻片，盖上盖玻片进行光镜下观察确认是否裂解充分。 3.注：RIPA裂解液有（中）和（强）裂解强度两种，可以根据组织类型进行调
整，以提高裂解效率。
4.超声处理10–15s，以完成细胞裂解并剪切DNA，以降低样品粘度和提升蛋
白溶解度。
注意：为确保组织细胞充分裂解，建议进行超声破碎。调节超声仪至适宜频率与功率（超声功率不宜过大，并设置超声间歇，以防止超声探头过度产热），将超声探头置于样本裂解液中部，但不触碰管壁或管底，进行冰浴超声。
超声循环设置如下：
超声3s，暂停10s，重复3-5次。
5.超声处理后将样品继续置于冰上孵育30min。
6.将上述裂解后样品，于4℃，12000rpm，离心15-20min，取上清到一个新
的EP管，置于冰上备用。
●细胞样品蛋白提取方法
1.对于贴壁细胞：从培养物中吸出培养基，用1×PBS洗涤细胞后，加入含有
利率汇率蛋白酶抑制剂（必要时还要加入磷酸酶抑制剂）的RIPA裂解液（6孔板每孔100µl或10cm直径的平板5
00µl）来裂解细胞，然后立即从板上刮下细胞并将提取物转移至EP管，置于冰上。
2.对于悬浮细胞：将悬浮细胞连同培养基转移到15ml离心管，室温1000rpm
离心5min，收集细胞沉淀，然后加入含有蛋白酶抑制剂（必要时还要加入磷酸酶抑制剂）的RIPA裂解液(6孔板每孔100µl或10cm直径的平板500µl)，用加样器吸打几次后转入一个新的EP管，置于冰上来裂解细胞。
3.超声处理10–15s，以完成细胞裂解并剪切DNA，以降低样品粘度和提升蛋
白溶解度。
注意：为确保组织细胞充分裂解，建议进行超声破碎。调节超声仪至适宜频率与功率（超声功率不宜过大，并设置超声间歇，以防止超声探头过度产热），将超声探头置于样本裂解液中部，但不触碰管壁或管底，进行冰浴超声。
超声循环设置如下：
超声3s，暂停10s，重复3-5次。
4.超声处理后将样品继续置于冰上孵育30min。
5.将上述裂解后样品，于4℃，12000rpm，离心15-20min，取上清到一个新
的EP管，置于冰上备用。
（二）蛋白定量
1.配制工作液：根据标准品和样品数量，按体积比A:B(50:1)配制适量BCA
工作液，充分混匀。BCA工作液室温24小时内稳定。
2.稀释标准品：取10微升标准品用PBS稀释至100ul（标准品一般可用PBS
稀释），使终浓度为0.5mg/ml。将标准品按0,1,2,4,8,12,16,20ul加到96孔板的蛋白标准品孔中，加PBS补足到20ul。
3.将稀释后（一般稀释5倍）的适当体积样品加入96孔板的样品孔中，补加PBS纳米材料
到20ul。
4.各孔加入200ul BCA工作液，37℃放置30分钟。
5.将96孔板冷却到室温，用酶标仪562nm测定OD值，根据标准曲线计算
出蛋白浓度，理想的蛋白浓度应为1-5µg/µl。
注意：对于过高的样品浓度，我们建议将样品用RIPA裂解液进行合理稀释并充分混匀后，再进行一次浓度测定为宜。
（三）电泳上样样品的制备石碳酸
1.在上样前，建议用提取样品用的RIPA裂解液将制备的组织、细胞蛋白样品的
浓度统一调整为相同浓度并充分混匀，最好都在3-5µg/µl。
2.上样量为20-40µg(如果是纯蛋白，上样量为100ng)，根据上样量计算好体积，
每管样品分别与4×蛋白上样缓冲液按体积比1:3混匀。
av大片3.煮沸5-10min，使样品还原变性，然后立即放于冰上备用。
4.对于剩余的样品，可以统一加入4×蛋白上样缓冲液后，将样品在-20℃或-80℃
保存。
（四）电泳
1.SDS-PAGE凝胶的制备
根据要检测的目的蛋白分子量范围，参考下表选择合适的分离胶浓度灌制分离胶，加入保护层（可小心加入0.5ml去离子水封压胶面）。待分离胶凝固后，倒出保
护层的去离子水，再灌注浓缩胶。根据样品数量和体积，选择合适的梳子插入浓缩胶。待浓缩胶完全凝固后，小心拔出梳子，将凝胶放入电泳槽内。
2.蛋白上样与电泳
将上述变性处理后的样品低速短暂离心后，按照实验设计的上样顺序，分别加入样品孔中。最后，加入合适的预染蛋白Marker。浓缩胶恒压80V，分离胶150V电压条件下电泳，直至指示剂溴酚兰迁移至凝胶底部。
电泳合格标准：目的蛋白条带位于分离胶的中部，并且条带充分分离。
（五）考马斯亮蓝染（备选步骤）
在进行正式实验前，对于刚刚制备的蛋白样品，可取少量上样电泳后，把整张胶用考马斯亮蓝染进行初步鉴定，以确定样品的质量。然后，再进入正式实验。（六）蛋白转膜（湿转法）
原理：蛋白因结合SDS而带负电荷，在电场中从胶转移至膜上。
1.将PVDF膜在无水甲醇中浸泡1-3min，再孵育于冰冷的电转缓冲液中5min。
胶也可以在转膜液中平衡3-5min，防止转膜时条带变形。
电流源2.制作转膜“三明治”
湿式转膜三明治排列顺序：海绵/吸水纸/胶/膜/吸水纸/海绵，全部紧密排列，特别是胶与膜之间不能留有气泡
三明治安装的方向：负极与胶同侧，向正极方（膜）迁移。
膜的面积：5.2*8.4cm
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