DOI: 10.3969/j.issn.1673-713X.2018.06.015·
技术与方法·重组纤溶酶抑制剂Textilinin-1蛋白含量 兰海英，康乐，陈宏超，李娜，徐梅
Textilinin-1 是从拟眼镜蛇Pseudonaja textilis textilis 中提取的Kunitz 型蛋白酶抑制剂，具有纤溶酶抑制活性，可抑制基于纤溶酶被激活导致纤维蛋白溶解所导致的出血，因此具有开发为止血药的潜力，可以作为外科手术中抑肽酶的替代药物[1]。目前已有含Textilinin-1 基因的重组毕赤酵母菌种，能高效表达目的蛋白[2]。
蛋白质含量测定是重组蛋白类药物质量控制中的重要指标之一，准确的蛋白质含量测定对产品的分装、比活性计算、残留杂质的限量控制以及其他理化特性测定均具有重要意义[3]。在研究过程中，我们发现不同方法测定的Textilinin-1 蛋白含量结果差异很大，表明结果的准确与使用的方法有相关性。为了提高产品质量指标的准确性以及未来生产中的工作效率，我们比较分析了凯氏定氮法、BCA 法和紫外吸收法在Textilinin-1 蛋白含量测定中的精确性和准确性，结果表明紫外吸收法是更适合于测定Textilinin-1 蛋白含量的质量控制方法。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1供试品中试生产的 3 个批次的Textilinin-1 蛋白原液20160804、20160810 和20160819；对照品牛血清白蛋白（BSA）购自美国Sigma 公司，批号WXBC3531V。
1.1.2主要试剂及仪器BCA 蛋白质定量检测试剂盒购自生工生物工程（上海）公司；盐酸标准滴定液购自沈阳化学试剂厂；催化剂片购自丹麦福斯公司；浓硫酸、盐酸、三羟甲基氨基甲烷（Tris）等试剂均为国产分析纯；Kjeltec TM 8400 凯氏定氮仪和Tecator TM Digestor 消化炉购自丹麦福斯公司；Biotek Epoch2 多功能酶标仪购自美国伯腾仪器有限公司；UV5Bio 紫外分光光度计购自美国梅特勒公司。1.2 方法东方城市花园会所
1.2.1 样品50 mmol/L 的Tris-HCl（pH 7.5）为空白对照；供试品为 3 批次Textilinin-1 蛋白原液；BSA 用空白对照液溶解配成40 mg/ml 的溶液作为对照品。
1.2.2凯氏定氮法按照Kjeltec TM8400 自动定氮仪使用操作规程对样品定氮。上述样品分别准确量取 2 ml 加入消化管，同时加入一片催化剂片及10 ml 浓硫酸，置消化炉上，采取逐步升高温度的方法250 ℃30 min，330 ℃50 min，420 ℃ 2 h 进行消化后冷却至室温。将样品置于凯氏定氮仪上定氮，供试 品和对照品测定结果分别除以各自蛋白的氮含量系数15.90%（Textilinin-1）和16.45%（BSA 蛋白），即得到供试品和对照品的蛋白质含量。供试品和对照品都平行测定 3 次。
1.2.3 BCA 法按照BCA 蛋白质定量检测试剂盒的说明书进行操作。562 nm 检测波长下，采用酶标板法在酶标仪中进行测定，3 批次供试品的检测值应该落在标准曲线范围内，最终的稀释倍数为20160804 稀释400 倍，20160810 稀释240 倍，20160819 稀释504 倍，对照品稀释100 倍，所有检测样品均进行 3 个平行稀释。根据标准曲线，得到稀释样品的蛋白浓度，再乘以稀释倍数得到样品浓度。
1.2.4 紫外吸收法将 3 批次供试品20160804 稀释100 倍，20160810 稀释60 倍，20160819 稀释126 倍，对照品稀释40 倍，所有检测样品均进行 3 个平行稀释。用1.0 cm 光程的石英比皿进行检测。在全波长扫描模式下进行扫描，得到Textilinin-1 蛋白和BSA 蛋白的最大吸收波长（277 nm 和278 nm）。在各自的最大吸收波长下，确保吸光值（A）在0.3 ~ 0.7 之间。根据朗伯-比尔定律C =（A / ε）× 10 求得蛋白浓度。ε 为蛋白的百分比消光系数。Textilinin-1 蛋白的ε 经本实验室前期工作确证为7.3，BSA 蛋白的ε 为6.6[4]。
2 结果
2.1 BCA 法的标准曲线
以试剂盒中的BSA 标准品浓度为横坐标，以其各浓度在562 nm 处吸光值为纵坐标，绘制标准曲线（图1）。得到回归方程y = 0.952x + 0.121，线性相关系数r2 = 0.997，表明线性关系良好。
A
5
6
2
n
m
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0.2 0.4 0.6
浓度（mg/ml）
图 1BCA 法标准曲线图
作者单位：110171 沈阳，辽宁远大诺康生物制药有限公司
通信作者：徐梅，Email：xumei@nkbp
收稿日期：2018-05-31
2.2 3 种检测方法对蛋白含量测定结果比较
3 种检测方法对蛋白含量测定结果见表1。
由表 1 结果可以看出，3 个平行检测值的变异系数均< 5%，说明实验操作过程误差小，实验结果可靠。对照品BSA 溶液的3 种检测方法的蛋白含量结果接近一致，而3 批原液的检测结果，凯氏定氮法与紫外吸收法检测结果接近，BCA 法则比其他两种方法检测值高出50% 以上，详细的比较结果见表2。中国林业局
是什么对供试品Textilinin-1 蛋白与标准品BSA 蛋白的还原性氨基酸数量进行比较分析，结果见表3。Textilinin-1 蛋白中含有的还原性氨基酸比例为15.25%，BSA 蛋白的比例为9.78%。3 讨论
曲耀成和姚雪[5]将蛋白含量测定方法系统地分成3 类：标准定量法（包括凯氏定氮法和氨基酸分析法）、比分析法（包括Lowry 法、双缩脲法、BCA 法和Bradford 法）以及紫外吸收法。本实验采取的 3 种检测分属于此 3 类方法。
凯氏定氮法是一种通过含氮量分析进行蛋白质含量测定的经典方法，其优点是定量准确，重现性好，被国际国内作为法定的标准检验方法。其缺点是操作复杂费时，试剂消耗量大。本实验对样品进行的凯氏定氮测定结果可以作为标准定量，以寻更简便、快速、准确的方法。
表 1 3 种蛋白含量测定方法的测定结果
样品凯氏定氮法（mg/ml）BCA 法（mg/ml）紫外吸收法（mg/ml）平行1 63.70 100.16 64.37
平行2 65.25 96.46 61.88
平行3 63.33 99.78 64.02
s
x±64.09 ± 1.01 98.80 ± 2.04 63.42 ± 1.35 20160804 原液
CV 1.59% 2.06% 2.12%
平行1 45.03 75.18 44.55
平行2 44.72 75.40 43.24
平行3 43.58 74.95 44.16
s
x±44.44 ± 0.76 75.18 ± 0.23 43.98 ± 0.67 20160810 原液
CV 1.72% 0.30% 1.53%
平行1 76.48 117.83 75.16
平行2 76.51 128.63 71.84
平行3 76.92 119.10 71.66
s
x±76.64 ± 0.25 121.85 ± 5.90 72.89 ± 1.97 20160819 原液
CV 0.32% 4.84% 2.70%
平行1 36.47 36.55 39.00
平行2 38.02 36.22 39.83
平行3 37.75 37.51 39.85
s
x±37.42 ± 0.83 36.76 ± 1.46 39.56 ± 0.48
BSA 溶液
CV 2.21% 3.97% 1.22%
表 2 3 种检测方法的蛋白含量差异率的比较
方法 20160804 原液（mg/ml）20160810 原液（mg/ml）20160819 原液（mg/ml）BSA 溶液（mg/ml）凯氏定氮法（A） 64.09 44.44 76.64 37.42
BCA 法（B）98.80 75.18 121.85 36.76 差异率（|B-A|/A）54.16% 69.17% 58.99% 1.76% 紫外吸收法（C） 63.42 43.98 72.89 39.56
BCA 法（B）98.80 75.18 121.85 36.76 差异率（|B-C|/C） 55.79% 70.94% 67.17% 7.08% 凯氏定氮法（A） 64.09 44.44 76.64 37.42 紫外吸收法（C） 63.42 43.98 72.89 39.56 差异率（|C-A|/A） 1.05% 1.04% 4.89% 5.72%
表 3Textilinin-1 蛋白和BSA 蛋白中还原性氨基酸数量的比较
蛋白质总氨基酸数量（个）Cys（个）Tyr（个）Trp（个）还原性氨基酸数量（个）还原性氨基酸百分比Textilinin-1 59 6 3 0 9 15.25%
今年疫情发展趋势BSA 583 35 20 2 57 9.78%
BCA 法反应原理为蛋白质将二价铜离子还原成亚铜离子，后者在碱性条件下与BCA 络合生成紫红络合物。此化合物在562 nm 处有最大吸收波峰，反应物的颜和蛋白浓度在一定范围内具有线性关系。BCA 法反应原理包括两个方面：一是蛋白中的肽键将Cu2+还原为Cu+，并且在60 ℃条件下，肽
键将Cu2+还原为Cu+的作用比在室温更大；二是蛋白中的氨酸（Trp）、酪氨酸（Tyr）、半胱氨酸（Cys）等还原性氨基酸将Cu2+还原为Cu+，这一反应与温度关系不大[6]。本研究中，3 批原液的BCA 法检测值均高于凯氏定氮法检测值的50% 以上，说明BCA 法中使用的标准品BSA 蛋白不能准确地定量供试品蛋白，其原因是两种蛋白之间的差异性较大，这些差异可能与蛋白质的氨基酸序列、等电点、蛋白质结构以及能够引起蛋白颜反应产生显著变化的侧链或辅基等有关[7]。表 3 中供试品蛋白含有的还原性氨基酸比例为15.25%，而标准品BSA 蛋白的比例仅为9.78%。因此，BCA 法检测供试品蛋白含量偏高的主要原因可能是因为供试品中还原性氨基酸含量比标准品BSA 中还原性氨基酸含量高50% 以上，从而增加了Cu2+还原为Cu+的数量，因此Cu+与BCA 络合生成紫红络合物的产物就增加了，相应的检测值就高。
比分析法中的其他方法的蛋白含量测定原理和BCA 法相似，因此，通过BCA 法实验结果可以得到如下提示：在采用比分析法之前，可以先对待测样品与标准品的氨基酸序列进行比较，如果待测样品的还原性氨基酸的含量与标准品相差较大时，就不适宜采用比分析法进行测定。如果想要采用比分析法定量，只有采用与待测样品相同的蛋白质作为标准品，才能有效避免实验误差。
紫外吸收法的原理是由于氨酸、酪氨酸以及苯丙氨酸结构中的苯环含有共轭双键，因此赋予了蛋白质在280 nm 处的紫外吸收特性。根据朗伯-比尔定律，在已知光程和消光系数的前提下，通过测定蛋白样品在波长280 nm 的吸收值，即可获得蛋白含量。本实验结果表明用紫外吸收法与凯氏定氮法测
定供试品蛋白含量差异小于5%，其结果接近准确值。同时，与其他方法相比较，紫外吸收法还具有操作简单、快速、成本低、无污染的优势，并且测定后样品还可以回收使用。本方法的核心问题就是消光系数的确定，一般来说，通过基因重组技术获得的蛋白质药物，其序列信息已知，可以通过Edelhoch 公式即ε280 =（5500 × nTrp）+（1490 × nTyr）+（125 × n S-S）计算蛋白的理论摩尔消光系数[8]。同时，在一般情况下获得的重组蛋白的纯度较高，通过凯氏定氮法准确定量蛋白质量，通过朗伯-比尔定律计算得到实测消光系数，并与理论消光系数对比，可以进一步确证消光系数，这样就能保证紫外吸收法测定蛋白含量的准确性。本实验的供试品蛋白为含有59 个氨基酸的蛋白质，根据其Trp、Tyr 及形成二硫键的数量，得到的理论摩尔消光系数为4845，再除以蛋白分子量，得到理论百分比消光系数为7.2。凯氏定氮法定量的供试品蛋白溶液测定277 nm 下的紫外吸收值，通过公式计算得到实测的百分比消光系数为7.3，与理论值相差为1.4%，考虑到蛋白质在自然状态下的空间结构也许会对消光系数产生影响，因此采用实测百分比消光系数值7.3。不同的蛋白可能会存在理论值与实测值差异较大的情况，因此，在对消光系数赋值时，都需要进行确证，以保证后续工作的准确性。目前，已有多种重组蛋白和抗体采用紫外吸收法进行蛋白含量的测定[9-11]。
通过对本研究结果进行比较分析，紫外吸收法具有准确、操作简单、快速的优势，因此确定紫外吸收法用于重组纤溶酶抑制剂Textilinin-1 的蛋白含量测定。
通过对 3 类蛋白质定量检测方法的研究进行如下总结：对于还未获得蛋白标准品的情况下，可以先采
用标准定量法（凯氏定氮法或氨基酸分析法）进行标准蛋白的标定及消光系数的测定，并与理论消光系数对比确证。当得到标准蛋白后，蛋白含量的测定可以采用比分析法；当确证消光系数后，可以采用紫外吸收法。在实际工作中，对于一个全新的蛋白药物，在选择和确定检测方法时，尤其是涉及建立质量标准的研究，都需要根据目标蛋白的属性选择不同原理的方法、不同厂家的试剂进行系统分析和对比研究，最终确定合适的测定方法，保证实验结果的科学性和准确性。
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·协会之窗·
关于公布2018 年第一批行业信用等级评价结果的通知
为进一步贯彻落实《国务院关于印发社会信用体系建设规划纲要（2014 – 2020 年）》（国发〔2014〕21 号）、《民政部、发展改革委、工业和信息化部、商务部等八部委<；关于推进行业协会商会诚信自律建设工作的意见>》（民发〔2014〕225 号）及《国务院关于建立完善守信联合激励和失信联合惩戒制度加快推进社会诚信建设的指导意见》（国发〔2016〕33 号）等相关文件的精神，推进行业信用体系建设，加强企业信用信息动态管理，中国医药生物技术协会在全国范围内开展医药生物技术行业信用等级评价工作。
本着公开、公平、公正、科学的原则，经第三方专业评价机构北京国富泰信用管理有限公司严格评价
并通过协会信用评价委员会审核，现将授信企业予以公布，有效期三年，中国医学科学院医学生物学研究所AAA 级，北昊干细胞与再生医学研究院有限公司 A 级。
药物分析技术分会成立
2018 年10 月20 – 21日，由中国医药生物技术协会主办，清华大学承办的“中国医药生物技术协会药物分析技术分会成立大会暨药物分析技术创新发展高峰论坛”在京隆重召开。会议以“前沿交叉，创新引领”为主题，吸引近200 位药学及交叉学科权威专家与药物分析同行参与出席。会议同期进行中国医药生物技术协会药物分析技术分会选举工作，药物分析技术分会在京宣布正式成立。
为进一步积聚全国药物分析领域的智慧，凝聚学科发展共识，凝练学科发展方向，有力地促进我国药物分析学科的健康发展，促进学科科研和教学水平提升，促进学科人才队伍的发展壮大，促进我国药物分析最新成果和优质资源的开放共享，促进我国药物分析技术的转化应用，在国家自然科学基金委和国家药典委员会的支持下，经中国医药生物技术协会常务理事会批准，成立药物分析技术分会，分会秘书处设在清华大学。经大会选举产生了主任委员罗国安；副主任委员贺浪冲、曾苏、再帕尔•阿不力孜、毕开顺、张尊建。聘任了秘书长梁琼麟；副秘书长王嗣岑、余露山、许风国。
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