合成与克隆
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技术通讯…
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文章编号:1009—0002(2005)03-0242—03
基质金属蛋白酶组织抑制剂一2基因的人工合成与克隆
闰训友1,2，赵洪亮，张惟广，薛冲，熊向华，刘志敏
1.军事医学科学院生物工程研究所，北京100071;
2.西南农业大学食品科学学院，重庆400716
研究报告
【摘要]根据GenBank报道的基质金属蛋白酶组织抑制剂-2(TIMP-2)氨基酸序列和毕赤酵母偏爱密码子设计，通过化学方 法合成得到适合在毕赤酵母中表达的目的TIMP一2基因序列，并将其克隆到质粒pPIC9中，构建了pPIC9一T2表达载体,
愉悦和痛苦PCR鉴定及测序结果表明得到了正确的TIMP-2基因序列.
[关键词]基质金属蛋白酶组织抑制剂一2；人工合成；克隆
[中图分类号]Q781[文献标识码]A ArtificialSynthesisandCloneofTissueInhibitorofMetalloproteinase-2
Y ANXun-you'2,ZHA0Hong-liang,ZHANGWei-guang~,XUEChong, XIONGXiang-hua,LIUZhi—min
1.InstituteofBiotechnology,AcademyofMilitaryMedicalSciences,Beijing10007l;
2.CollegeofFoodScience,SouthwestAgriculturalUniversity,Chongqing400716,China
[Abstract】Toconstructhumantissueinhibitorofmetalloproteinase一2andexpressitinP.pastoris.Thesequencewasde—signedaccordingtotheaminoacidsequenceoftheTIMP-2andhigh—levelexpressionsequencesofP,pastoris.TheTIMP一
2genewasgainedbyartificiallysynthesismethod.ThegenewasclonedintopPIC9toconstru ctarecombinantvector
pPIC9一T_2,TheconstructedTIMP-2genewasidentificatedthroughPCRandDNAsequenceanalys is.
[Keywords]tissueinhibitorofmetalloproteinase-2;artificialsynthesis;clone
基质金属蛋白酶(matrixmetalloproteinases,MMPs)
是降解细胞外基质的重要酶类，几乎能降解细胞外基
质的所有成分.现已发现26种基质金属蛋白酶，统称
教授女儿的婚事
为基质金属蛋白酶家族.MMPs能通过破坏基质的降解
平衡而促进肿瘤细胞突破基底膜和细胞外基质构成的
组织屏障，从而侵袭周围组织.基质金属蛋白酶组织抑
制剂(tissueinhibitorofmetalloproteinases,TIMPs)是
MMPs的天然抑制物，是一组能抑制MMP活性的多功
能因子家族，目前已经在人体内发现了4种TIMP【I.2】.
由于TIMPs是MMPs的天然抑制剂，而MMPs在肿瘤
侵袭和转移中具有独特的靶点，因此TIMPs已经成为
肿瘤研究热点，并可能成为新的抑制肿瘤药物pJ.其中,
TIMP一2既能结合无活性状态的和激活状态的相对分
子质量为72000的Ⅳ型胶原，又可以终止金属蛋白酶
家族所有成员的水解活性，因而在针对肿瘤侵袭和转
移的研究中备受关注.--.本工作以GenBank报道的
TIMP一2基因蛋白序列为目标，结合毕赤酵母的偏爱密
码子，利用化学合成与PCR相结合的方法得到完整的
[收稿日期]2004一ll一26
【基金项目]国家重大科技专项(2002AA2Z345B)
[作者简介]闫训友(1978一)，男，硕士研究生
【通讯作者]刘志敏,(E-mail)***************.corn
TIMP一2基因，并且构建了pPIC9一T2表达载体，为进一
步研究人工合成基因在毕赤酵母中的表达和TIMP一2
蛋白的性质打下了基础.
1材料和方法
1.1材料
大肠杆菌DH5a，质粒pHC9由本室保存；限制性内切酶,
ToaDNA聚合酶,DNA连接酶，质粒快速提取试剂盒分别购自
华美公司，北京博大公司和上海生工生物工程公司；引物合成和 序列测定由上海博亚公司完成.
1.2方法
根据GenBank报道的TIMP一2的氨基酸序列(图1)和毕赤
酵母的偏爱密码子，合成了24条PCR引物(表1)，其中22条寡
核苷酸序列用于PCR扩增目的基因(正向引物l1条分别命名为
Fl—Fl1，反向引物ll条分别命名为R1～R11)，每条引物长50
bp(R1l为57bp)，其内部都有25bp的反向互补序列.寡核苷
酸片段组装成合成基因的序列见图2,2条引物用于克隆至
pPlC9质粒中(上游引物El含有XhoI酶切位点，下游引物E2
含有EcoRI酶切位点).
本实验中，正反引物Fn和Rn互为模板和引物，进行各自
延伸，以后生成的产物又成为下一步的模板和引物，经过55个
循环后可以得到一条完整的目的基因(图2).
闰训友等：基质金属蛋白酶组织抑制剂一2基因的人工合成与克隆243
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图ITIMP-2的氨基酸序列闫安书法
表1
引物
PCR引物序列pubmed
序列TGTTCCTGTTCCCCAGTCCACCCACAACAAGCTTTCTGTAACGCTGACGT CGTTATCCGTGCTAAGGCTGTCTCCGAGAAGGAGGTCGACTCCGGTAACG ACATCTACGGTAACCCAATCAAGCGTATCCAATACGAGA TCAAGCAAATC AAGATGTTCAAGGGTCCAGAGAAGGACATCGAGTTCA TCTACACCGCTCC
ATCCTCCGCTGTCTGTGGTGTCTCCTTGGACGTCGGTGGTAAGAAGGAGT ACTTGATCGCTGGTAAGGCTGAGGGTGACGGTAAGATGCACATCACCTTG TGTGACTTCATCGTCCCA TGGGACACCTTGTCCACCACCCAAAAGAAGTC CTTGAACCACCGTTACCAAATGGGTTGTGAGTGTAAGATCACCCGTTGTC CAATGATCCCATGTTACATCTCCTCCCCAGACGAGTGTTTGTGGATGGAC TGGGTCACCGAGAAGAACATCAACGGTCACCAAGCTAAGTTCTTCGCTTG TATCAAGCGTTCCGACGGTTCCTGTGCTTGGTACCGTGGTGCTGCTCCAC GGAGACAGCCTTAGCACGGATAACGACGTCAGCGTTACAGAAAGCTTGTT CGCTTGATTGGGTTACCGTAGATGTCGTTACCGGAGTCGACCTCCTTCTC CCTTCTCTGGACCCTTGAACATCTTGA TTTGCTTGATCTCGTATTGGATA GGAGACACCACAGACAGCGGAGGATGGAGCGGTGTAGATGAACTCGATGT CCCTCAGCCTTACCAGCGATCAAGTACTCCTTCTTACCACCGACGTCCAA TGTCCCATGGGACGATGAAGTCACACAAGGTGATGTGCATCTTACCGTCA ACCCA TTTGGTAACGGTGGTTCAAGGACTTCTTTTGGGTGGTGGACAAGG GAGGAGATGTAACA TGGGATCATTGGACAACGGGTGA TCTTACACTCACA CGTTGATGTTCTTCTCGGTGACCCAGTCCATCCACAAACACTCGTCTGGG ACAGGAACCGTCGGAACGCTTGATACAAGCGAAGAACTTAGCTTGGTGAC TGGGTCCTCGATG
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GGGAATTCTCA TTA TGGGTCCTCGATGTCCAAGAACTCT
2结果与讨论
2.1PCR产物的琼脂糖凝胶电泳鉴定
通过一步PCR的方法扩增出目的基因片段.扩增
产物经琼脂糖电泳检测，在约618kb处有明显的扩增
片段(图3).酶切鉴定表明目的基因已经克隆到pPIC9
载体中(图4).
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