技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种冠状病毒主蛋白酶3CLpro抑制剂，及其在制备抗病毒药物中的应用。 背景技术
冠状病毒主蛋白酶3CLpro也被称为3C-like protease(3CLpro)，因为其切割位点的特异性与微小RNA病毒(picornavirus)的3C蛋白酶(3C protease)很相似，两者并称为3CLpro。3CLpro能够处理病毒中的多聚蛋白，病毒RNA在进入人类细胞后最初被翻译成为多聚蛋白。3CLpro蛋白酶可从多聚蛋白中切割出12个更小的蛋白，而这些蛋白质将会参与病毒RNA的复制。由于3CLpro作为一个重要的蛋白酶，在抑制病毒复制的过程中起到了至关重要的作用且人体内没有同源蛋白，故3CLpro主蛋白酶是一个抗病毒药物研发的理想靶点，此外，3CLpro在β冠状病毒中保守性高，筛选出的3CLpro抑制剂具有一定程度的广谱抗冠状病毒能力。目前还没有发现具有疗效好、特异性高的小分子冠状病毒主蛋白酶3CLpro抑制剂。
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发明内容
决策支持系统本发明的目的是提供一种冠状病毒主蛋白酶3CLpro抑制剂，及其在制备抗病毒药物中的应用。
为实现上述目的，本发明采用技术方案为：
一种冠状病毒主蛋白酶3CLpro抑制剂，其特征在于：抑制剂含具有抗炎作用的药物、天然产物中的一种或几种。
所述抑制剂含拉唑类药物、磺胺嘧啶银、金诺芬、硫柳汞和布罗波尔分中的一种或几种。
所述的拉唑类药物、磺胺嘧啶银、金诺芬、硫柳汞和布罗波尔分别为如下结构所示的药物：
其中：R 1为H或CH 3；R 2为H，OCH 3，OCH 2OCH 3或O-C-F 3；R 3为H，CH 3或OCH 3；R 4为H，OCH 3，OCHF 2或吡咯环；
离子交换层析
所述拉唑类药物为艾普拉唑、埃索美拉唑、奥美拉唑、雷贝拉唑钠、兰索拉唑或泮托拉唑，具体结构式为：
所述抑制剂含从姜科姜黄属植物、龙胆科獐芽菜属植物、爵床科穿心莲属植物、毛茛科翠雀属植物、马鞭草科牡荆属植物中提取出的化合物及其异构体或白皮杉醇或茶黄素。 所述从姜科姜黄属植物蓬莪术中提取出来的二苯庚烯类化合物如结构式(I)所示化合物或其异构体；
其中，R 1和R 3可相同或不同的选自H或OCH 3；R 2，R 4和R 5可相同或不同的选自H或OH；
从龙胆科獐芽菜属植物瘤毛獐牙菜或茄科假酸浆属植物假酸浆中提取出来的苯并原酮类化合物如结构式(II)所示化合物或其异构体
其中：R 1为H，D-葡萄糖或OH；R 2，R 3和R 5可相同或不同的选自H或OH；R 4为H，OCH 3或OH；
从爵床科穿心莲属植物穿心莲或毛茛科翠雀属植物翠雀中提取，或者通过穿心莲内酯为基本母核合成得到的二萜类化合物，n大于等于1，如结构式(III)所示化合物或其异构体：
其中，R 1为H，(CH 2) nOH，CH 3，酰胺或 R 2为H，OH或 R 3为H或OH；
从马鞭草科牡荆属植物蔓荆子中提取出来的黄酮类化合物，如结构式(IV)、(V)所示化合物或其异构体
心理月刊杂志其中，R 1为H，OH，D-葡萄糖，L-鼠李糖，芸香糖或 R 2，R 3和R 5各自独立地为H或OH；R 4为H，OH或OCH 3；R 6为H，OH，D-葡萄糖，L-鼠李糖或芸香糖；
白皮杉醇结构式为(VI)，茶黄素结构式为(VII)，
所述天然产物为如下化合物1～16中任一种或该化合物的异构体；
气辅成型所述抑制剂在制备靶向冠状病毒主蛋白酶3CLpro的抗病毒药物中的应用。
所述的含有冠状病毒蛋白酶3CLpro的病毒包括：多种冠状病毒，如新型冠状病毒、SARS病毒、MERS病毒等。
所述抗病毒药物含所述抑制剂和药学上可接受的载体。
所述的抗病毒药物的剂型为口服剂型、注射剂型和外用剂型。
所述的在药学上可接受的载体为适用于制成口服、注射、吸入、粘膜给药剂型的载体。给药方式可根据临床需要选择口服、注射或者局部外用，根据给药途径的选择相应的药物剂型，口服剂型包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、口服溶液、微丸剂、微片剂、含片，注射剂型包括粉针剂、注射液、脂质体微球注射液，外用剂包括溶液、混悬液、乳剂等。
本发明技术方案的有益效果及特点：
本发明针对冠状病毒主要蛋白酶3CLpro的抑制剂为天然产物或对该蛋白酶具有抑制性的药物。本发明抑制剂能有效地抑制疗冠状病毒蛋白酶3CLpro，可以用于制备抗病毒药物；可根据临床需要选择不同的给药方式或者剂型。
本发明获得具有抗炎作用的药物以及天然产物，如拉唑类药物、磺胺嘧啶银、金诺芬、硫柳汞和布罗波尔以及天然产物与冠状病毒蛋白酶3CLpro，具有较强的结合亲和力并且直接抑制冠状病毒主蛋白酶3CLpro的酶活性。并且基于酶活性评价体系和MST结合力测定试验可见上述药物与冠状病毒蛋白酶3CLpro具有较强的结合亲和力并且直接抑制冠状病毒蛋白酶3CLpro的酶活性，可以作为冠状病毒蛋白酶3CLpro的抑制剂并用于抗病毒药物的制备。
附图说明
图1为本发明实施例1提供的重组冠状病毒蛋白酶3CLpro的体外酶促表征和酶抑制试验。
(A)冠状病毒主蛋白酶3CLpro的底物饱和曲线。
(B)冠状病毒主蛋白酶3CLpro的EC50测定曲线。
(C)拉唑类药物、磺胺嘧啶银、金诺芬、硫柳汞和布罗波尔对冠状病毒蛋白酶3CLpro抑制活性的量效曲线。
图2为本发明实施例2提供的MST方法测定拉唑类药物与冠状病毒蛋白酶3CLpro之间的结合亲和力。
图3为本发明实施例3提供的重组冠状病毒蛋白酶3CLpro的体外酶促表征和酶抑制试验。
(A)冠状病毒主蛋白酶3CLpro的底物饱和曲线。
(B)冠状病毒主蛋白酶3CLpro的EC 50测定曲线。
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(C)天然产物对冠状病毒蛋白酶3CLpro抑制活性的量效曲线。
图4为本发明实施例4提供的MST方法测定天然产物与冠状病毒蛋白酶3CLpro之间的结合亲和力。
具体实施方式
通过结合以下实施例对本发明作进一步阐释，同时便于本领域技术人员深入理解对使用到的实验方法与核心思想作较为详尽的描述。
下述酶活性评价试验是在50mM Tris-HCl(pH7.3)，1mM EDTA条件下进行的，首先用一定浓度的DMSO配制一系列浓度的待检测药物溶液，将3CLpro蛋白溶液稀释到所需浓度，底物(MCA-AVLQSGFR(Dnp)-Lys-NH 2)溶于水中，配制成浓度为22μM的溶液，需要注意的 是底物溶液需要现用现配。药物与3CLpro蛋白于室温下反应1小时，利用酶标仪进行荧光检测。检测时先加入底物溶液，后加入药物与3CLpro蛋白反应后的混合溶液，启动程序进行检测。检测结果利用GraphPad Prism 7.0软件进行分析，拟合回归曲线得到IC 50值，IC 50数值越小，表示该药物对3CLpro蛋白的抑制作用越强。
MST结合力测定试验是利用Nano Temper完成，在50mM Hepes(pH7.3)和1mM EDTA条件下进行，首先用一定浓度的DMSO配制一系列不同浓度的待检测药物溶液，用buffer将3CLpro蛋白稀释到所需浓度，加入染料后于暗处染30min，完成后用空间排阻柱对3CLpro蛋白进行分离，收集分离后蛋白，并用Nano Temper对其进行检测，得到荧光吸收较好的3CLpro蛋白，该3CLpro蛋白与药物室温反应10min，再次利用Nano Temper进行检测，检测结果利用分析软件MO.AffinityAnalysis_x86进行处理，导入微量热泳动曲线，拟合出平衡解离常数K d值。K d值越小，表示药物和3CLpro蛋白的结和力越强。
基于酶活性评价体系以及靶向性验证，拉唑类药物、磺胺嘧啶银、金诺芬、硫柳汞和布罗波尔能够靶向性的抑制冠状病毒蛋白酶3CLpro活性。
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